張澤華，萬(wàn)淑媛，李 琴，劉福云，趙彩平

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100)

桃[Prunuspersica(L.)Batsch.]果實(shí)不耐貯藏，貨架期短，是制約桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要問(wèn)題之一。因此，研究桃果實(shí)的成熟軟化調(diào)控機(jī)制對(duì)延長(zhǎng)貯藏期十分重要。

植物激素ABA對(duì)果實(shí)的成熟軟化具有重要的調(diào)控作用。研究表明，ABA可以通過(guò)調(diào)控乙烯、細(xì)胞壁、生長(zhǎng)素和糖酸代謝相關(guān)基因來(lái)調(diào)控果實(shí)的成熟軟化[1-2]。Zhang等[3]對(duì)桃和葡萄的研究顯示，ABA主要在果實(shí)的成熟啟動(dòng)階段起重要調(diào)控作用，但Jacqueline等[4]在鱷梨中的研究表明，ABA的高峰出現(xiàn)在乙烯高峰之后。

9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED)是ABA合成途徑中的限速酶，對(duì)于ABA的合成至關(guān)重要[5-7]。NCED家族成員已在多個(gè)物種上被鑒定出來(lái)，且在進(jìn)化上較為保守[3,5,7-10]。值得注意的是，NCED家族成員中不是每個(gè)都與ABA合成相關(guān)。比如，擬南芥上鑒定出的9個(gè)NCED成員，只有5個(gè)與ABA合成相關(guān)[5]。在鱷梨上，NCED2為組成型表達(dá)，由于缺乏葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，所以很可能不參與ABA的合成[4]。

NCED對(duì)于果實(shí)的成熟具有重要的作用。在番茄上，沉默SlNCED1會(huì)延緩果實(shí)成熟進(jìn)程，使果實(shí)無(wú)法正常著色，質(zhì)地相關(guān)基因被下調(diào)[11]。此外，NCED基因表達(dá)也會(huì)受到外源ABA調(diào)節(jié)劑的影響。比如，外源ABA處理可以顯著提高草莓、櫻桃NCED基因的表達(dá)水平[12-13]。但有意思的是，在番茄上，外源ABA不會(huì)影響內(nèi)源ABA的積累和NCED的表達(dá)水平[3]，說(shuō)明不是所有的NCED都會(huì)響應(yīng)外源ABA。另外，沉默ABA代謝基因SlCYP707A2會(huì)導(dǎo)致SlNCED1表達(dá)水平上升，表明ABA在番茄體內(nèi)可能存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[11]。而在黃瓜果實(shí)未熟期噴施ABA，對(duì)黃瓜果實(shí)成熟沒(méi)有明顯的影響，但在轉(zhuǎn)色期噴施則可以使CsNCED1、CsNCED2基因的表達(dá)水平升高[14]。說(shuō)明NCED響應(yīng)外源ABA可能與果實(shí)所處生理階段有關(guān)。近年來(lái)，關(guān)于桃上NCED的研究有一些報(bào)道，但不系統(tǒng)。首先，桃NCED基因是否響應(yīng)外源ABA，Soto等[1]的研究表明，NCED對(duì)外源ABA的響應(yīng)特性取決于桃果實(shí)發(fā)育的生理階段。其次，ABA如何調(diào)控桃果實(shí)的成熟，Wang等[15]的研究顯示，PpERF3可以結(jié)合在NCED2/3的啟動(dòng)子上，正向調(diào)控NCED2/3的基因表達(dá)，說(shuō)明乙烯與ABA可能協(xié)同調(diào)控桃果實(shí)的成熟。此外，桃上的NCED家族成員的系統(tǒng)鑒定還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。NCED成員在不同桃品種之間是否存在不同的表達(dá)特性？不同的NCED成員之間對(duì)外源ABA的響應(yīng)是否一致？這些問(wèn)題都還未解決。

因此，本研究鑒定桃中的NCED家族成員，并分析其在不同器官、果實(shí)不同發(fā)育階段以及在不同耐貯性桃果實(shí)中的表達(dá)特性，以期明確與桃果實(shí)成熟可能相關(guān)的NCED基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以桃栽培品種‘淺間白桃’(QJBT)，‘秦王’(QW)和‘美秋’(QM)為試材，種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)桃種質(zhì)資源圃。

不同組織樣品的采集：以‘淺間白桃’品種為試材，采集根(須根，直徑2 mm左右)、莖(新梢)、葉(1 a生新梢上第2～4片成熟葉)、花(未完全展開(kāi)的花)、果實(shí)(幼果)。

果實(shí)發(fā)育期樣品的采集：以‘秦王’桃品種為試材，采集花后65 d、95 d和110 d的桃果實(shí)。

不同耐貯性果實(shí)樣品的采集：采摘處于商品成熟期的不耐貯藏的‘淺間白桃’和極耐貯藏的‘秦王’桃果實(shí)?！疁\間白桃’果實(shí)在采收當(dāng)天及貯藏過(guò)程中每隔2 d取樣，‘秦王’每隔4 d取樣。

1.2 試驗(yàn)處理

ABA處理及樣品采集：以‘美秋’為試材，在果實(shí)采收前一周，選擇樹(shù)型、長(zhǎng)勢(shì)、樹(shù)齡一致的3棵桃樹(shù)，在每棵樹(shù)的2個(gè)主枝上，分別用50 μmol/L的ABA和清水噴施，每隔3 d噴施1次，共噴施2次。在商品成熟期采收果實(shí)，在采收當(dāng)天及貯藏過(guò)程中每隔2 d取樣。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 桃NCED基因家族成員鑒定與生物信息學(xué)分析 在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(TAIR)下載所有的擬南芥NCED基因，以擬南芥AtNCED的基因序列在NCBI tblastn用于搜索桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，桃基因的完整氨基酸序列從薔薇科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(GDR)中獲得。所有檢索出的基因(E-value≤ 0.005)都利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)并使用保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，刪除不含保守結(jié)構(gòu)域的基因。使用SignalP 4.1Server分析信號(hào)肽。利用在線程序ExPASy ProtParam對(duì)PpNCED基因編碼蛋白的等電點(diǎn)和分子量進(jìn)行分析。使用MapDraw軟件將基因定位到染色體，根據(jù)其在染色體上的位置對(duì)其進(jìn)行命名。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)用MEGA 6.0軟件進(jìn)行構(gòu)建，采用鄰接法(NJ)，重復(fù)1 000次。

1.3.2 RNA提取和實(shí)時(shí)定量熒光PCR(qRT-PCR)分析 采用CTAB法提取RNA，通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，用紫外分光光度計(jì)來(lái)檢測(cè)OD260、OD280值，從而判斷RNA的純度和濃度。

表1 桃NCED基因家族定量引物Table 1 Primers for quantitative real-time PCR analysis of peach NCED genes family

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010和Spss 22對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，用Excel 2010繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃NCED基因家族成員的鑒定和生物信息學(xué)分析

2.1.1 桃NCED基因家族成員的鑒定 共鑒定出7個(gè)桃NCED基因家族成員：prupe.1G061300.1，prupe.1G255500.1，prupe.1G255500.2，prupe.2G014700.1，prupe.2G014700.2，prupe.4G082000.1，prupe.4G150100.1。所有成員均含有高度保守的視網(wǎng)膜色素上皮膜蛋白結(jié)構(gòu)域RPE65(圖1-a)。根據(jù)其染色體定位，分別命名為PpNCED1、PpNCED2a、PpNCED2b、PpNCED3a、PpNCED3b、PpNCED4和PpNCED5。NCED基因家族成員分布在3條桃染色體上，一號(hào)染色體上有3個(gè)PpNCED基因，二號(hào)和四號(hào)染色體上各有2個(gè)PpNCED基因(圖1-b)。7個(gè)NCED家族成員均無(wú)信號(hào)肽，PpNCED1～PpNCED5編碼的氨基酸長(zhǎng)度為427～632 aa，預(yù)測(cè)蛋白的等電點(diǎn)為5.64～7.24，分子質(zhì)量為47.30～70.35 ku (表2)。

表2 NCED蛋白理化特性Table 2 Physical and chemical properties of NCED protein

2.1.2 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 將桃、蘋果、葡萄、柑橘、櫻桃、梅、擬南芥上已報(bào)道的NCED基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，PpNCED1與梅PmNCED6同源性最高；而PpNCED2a、PpNCED2b與擬南芥的AtNCED4高度同源，PpNCED3a、PpNCED3b與擬南芥的AtNCED1同源性較高；PpNCED4與櫻桃PacNCED5基因同源性最高；PpNCED5與梅PmNCED1高度同源。此外，根據(jù)擬南芥上NCED基因家族成員的分類，將桃上的NCED基因分為兩個(gè)亞家族。其中，PpNCED1、PpNCED4、PpNCED5屬于亞家族Ⅰ；PpNCED2a、PpNCED 2b、PpNCED3a、PpNCED3b屬于亞家族Ⅱ(圖1-c)。

2.2 桃NCED基因家族成員組織特異性分析

如圖2所示，5個(gè)基因在不同的組織部位表達(dá)情況各不相同。其中，PpNCED1只在莖、葉中有表達(dá)。PpNCED2、PpNCED3均表現(xiàn)出在花中的表達(dá)量較高，在葉和莖中有少量表達(dá)，在根和幼果中表達(dá)量較低。PpNCED4在莖和花中表達(dá)量較高，在幼果中次之，在葉中表達(dá)量較低。PpNCED5在莖中大量表達(dá)，其次為根、花、幼果，在葉片中表達(dá)量較低。

2.3 果實(shí)發(fā)育期間NCED基因家族成員表達(dá)特性分析

為了研究NCED基因家族成員在桃果實(shí)發(fā)育階段中可能的作用，選取‘秦王’品種，分析花后65 d至果實(shí)成熟期NCED成員相對(duì)表達(dá)量的差異。圖3結(jié)果顯示，在花后65 d，果實(shí)中幾乎檢測(cè)不到PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5的表達(dá)豐度，而其后隨著果實(shí)的膨大和成熟，PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5均呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，且在果實(shí)成熟期達(dá)到表達(dá)高峰。

2.4 不同耐貯性桃果實(shí)成熟軟化期間NCED基因家族成員表達(dá)特性分析

為了研究NCED基因家族成員在桃果實(shí)成熟軟化中可能的作用，本研究分析‘淺間白桃’‘秦王’和‘美秋’果實(shí)采后貯藏期間NCED成員相對(duì)表達(dá)量的差異。圖4結(jié)果顯示，在不耐貯桃‘淺間白桃’和耐貯藏的‘秦王’果實(shí)的采后貯藏期間，PpNCED2的相對(duì)表達(dá)量均呈緩慢下降趨勢(shì)，且在采收當(dāng)天表達(dá)量最高。而PpNCED3在‘淺間白桃’中的相對(duì)表達(dá)量從采后0～2 d先下降，第2天開(kāi)始逐漸上升，在第6天達(dá)到表達(dá)高峰。PpNCED4、PpNCED5在‘淺間白桃’果實(shí)貯藏期間幾乎檢測(cè)不到表達(dá)量(圖4)。

PpNCED3、PpNCED4在‘秦王’果實(shí)貯藏期間的表達(dá)模式相似，均為雙峰曲線。PpNCED3的第一個(gè)表達(dá)高峰在采后第12天，第二個(gè)表達(dá)高峰在采后第24天。PpNCED4在采后第4天達(dá)到第一個(gè)表達(dá)高峰，此后迅速下降，在采后第20天達(dá)到第二個(gè)表達(dá)高峰。而PpNCED5在‘秦王’果實(shí)采收當(dāng)天表達(dá)量最高，之后逐漸下降，到采后第20天后呈緩慢上升趨勢(shì)(圖4)。

在‘美秋’果實(shí)采后貯藏期間，PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5整體均呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，PpNCED2、PpNCED3的表達(dá)量在貯藏的前2 d迅速升高，后呈下降趨勢(shì)，PpNCED3在貯藏末期表達(dá)量又升高。PpNCED4、PpNCED5表達(dá)量的變化趨勢(shì)較一致，均在采后的0～4 d表達(dá)量逐漸上升，在第4天后又均呈下降趨勢(shì)(圖5)。

試驗(yàn)結(jié)果還表明，在不同桃品種果實(shí)中，NCED家族成員的表達(dá)豐度存在差異。PpNCED2在‘秦王’和‘美秋’果實(shí)貯藏期間的整體表達(dá)量顯著高于‘淺間白桃’；而PpNCED3在‘秦王’果實(shí)中的整體表達(dá)量低于‘淺間白桃’和‘美秋’。

2.5 外源ABA處理后桃成熟軟化期間生理指標(biāo)變化及NCED基因家族成員的響應(yīng)特性

為了進(jìn)一步探究NCED基因家族成員在桃果實(shí)成熟軟化期間對(duì)外源ABA的響應(yīng)特性，對(duì)‘美秋’桃進(jìn)行外源ABA處理。結(jié)果顯示，外源ABA處理后，貯藏期間桃果實(shí)硬度始終低于對(duì)照果實(shí)，且在采后0 d和2 d差異顯著。此外，ABA處理和對(duì)照果實(shí)均表現(xiàn)出從貯藏0～4 d乙烯釋放量緩慢升高，4 d～6 d迅速升高并出現(xiàn)峰值，且外源ABA處理果實(shí)的乙烯釋放高峰顯著高于對(duì)照。外源ABA處理后，在采收當(dāng)天，PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5的表達(dá)均被顯著促進(jìn)；在貯藏第2天，PpNCED4、PpNCED5的表達(dá)量也顯著高于對(duì)照果實(shí)；而PpNCED2、PpNCED3在貯藏第2～4天的表達(dá)量被顯著抑制(圖5)?？偟膩?lái)說(shuō)，在貯藏前期，NCED家族成員表達(dá)量呈現(xiàn)出被外源ABA上調(diào)的趨勢(shì)，而中后期整體呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)。

3 討 論

桃果實(shí)深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，但其容易軟化腐爛是制約商品價(jià)值的重要原因。因此，關(guān)于桃果實(shí)成熟軟化的調(diào)控始終是一個(gè)研究熱點(diǎn)。ABA可以促進(jìn)果實(shí)的成熟軟化，而NCED作為ABA合成途徑中的限速酶，在該調(diào)控途徑中尤為關(guān)鍵[5-7]。許多物種中已經(jīng)鑒定出了NCED基因家族成員，且各物種中的家族成員數(shù)目不同，這可能與染色體加倍有關(guān)[5,16-17]。在本研究中，共鑒定出7個(gè)NCED基因，并發(fā)現(xiàn)它們都在NCED的第一和第二亞家族內(nèi)。在桃中關(guān)于NCED的研究報(bào)道大都聚焦于NCED第一亞家族的成員[1,15,18]，即本研究中鑒定出的PpNCED1、PpNCED4、PpNCED5。第二亞家族的成員相關(guān)報(bào)道較少。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，PpNCED1與葡萄VvNCED6和擬南芥的AtNCED6的同源性較高。VvNCED6可能參與調(diào)控葡萄的花色苷的積累[19]；而AtNCED6與擬南芥種子休眠相關(guān)[20]。在本研究中，PpNCED1在果實(shí)中幾乎不表達(dá)(圖2)，說(shuō)明PpNCED1可能不參與桃果實(shí)的成熟調(diào)控。PpNCED4與草莓FaNCED1同源性較高，F(xiàn)aNCED1在調(diào)控草莓果實(shí)成熟中發(fā)揮重要作用，沉默F(xiàn)aNCED1導(dǎo)致草莓內(nèi)源ABA水平降低及果實(shí)的不著色表型[21]。本研究中，PpNCED4在‘秦王’和‘美秋’成熟軟化期間均呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)(圖4，圖5)，說(shuō)明其可能與桃果實(shí)成熟相關(guān)。PpNCED5與櫻桃的PacNCED1高度同源，PacNCED1在櫻桃果實(shí)成熟過(guò)程中具有重要作用[13]，由此可以推斷桃PpNCED5也可能與桃成熟密切相關(guān)。

此外，本研究結(jié)果顯示，NCED基因家族成員的表達(dá)具有明顯的組織特異性，這與甜櫻桃中的研究結(jié)果相似[22]。在果實(shí)中表達(dá)的NCED基因家族成員數(shù)目在不同品種間也存在差異，在不耐貯藏的‘淺間白桃’果實(shí)中，只有PpNCED2、PpNCED3表達(dá)，而在極耐貯藏的‘秦王’果實(shí)和較耐貯藏的‘美秋’果實(shí)中，除PpNCED1外，其他NCED成員均有一定表達(dá)量(圖4，圖5)。

不同NCED成員在桃果實(shí)發(fā)育與成熟軟化過(guò)程中的表達(dá)模式既有相似之處，也存在差異。在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，PpNCED2、PpNCED3、PpNCED4、PpNCED5均表現(xiàn)出隨果實(shí)發(fā)育表達(dá)量升高，在成熟期達(dá)到表達(dá)高峰(圖3)；在果實(shí)貯藏期間，PpNCED2、PpNCED5的表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)(圖4)。番茄SlNCED1、柿子DkNCED1和甜櫻桃PacNCED1的表達(dá)量也表現(xiàn)出在果實(shí)綠熟期增加，在成熟轉(zhuǎn)變期達(dá)到高峰，后熟期迅速下降的趨勢(shì)[11,13,23]。而PpNCED2、PpNCED5在‘美秋’的成熟期間呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，表明不同品種間的表達(dá)模式存在差異(圖5)。在‘秦王’和‘美秋’貯藏期間，PpNCED3、PpNCED4的表達(dá)量均表現(xiàn)出較為一致的雙峰曲線變化趨勢(shì)，且伴隨著表達(dá)量高峰的出現(xiàn)，果實(shí)硬度迅速下降，因此，其可能與果實(shí)軟化相關(guān)(圖4，圖5)。

已有研究表明，ABA對(duì)NCED基因表達(dá)的調(diào)控與果實(shí)所處的發(fā)育階段有關(guān)。在桃果實(shí)膨大期(S3中期)噴施ABA，會(huì)抑制NCED基因的表達(dá)，而在S3/S4和S4時(shí)期，ABA處理后NCED基因表達(dá)量被上調(diào)[1]。在黃瓜果實(shí)未熟期噴施ABA對(duì)黃瓜果實(shí)成熟沒(méi)有明顯的影響，而在轉(zhuǎn)色期噴施則上調(diào)CsNCED1、CsNCED2基因的表達(dá)水平，促進(jìn)黃瓜果實(shí)的成熟[14]。本研究結(jié)果顯示，在果實(shí)成熟前1周，外源噴施ABA后，果實(shí)硬度顯著降低，乙烯釋放峰值顯著升高，表現(xiàn)出對(duì)果實(shí)成熟有顯著的促進(jìn)作用。外源ABA處理后，均表現(xiàn)出在貯藏早期顯著促進(jìn)PpNCED家族成員的表達(dá)，而在貯藏中后期顯著抑制PpNCED家族成員的表達(dá)，可能是負(fù)反饋調(diào)節(jié)的結(jié)果(圖5)。植物體內(nèi)的激素水平需要保持穩(wěn)態(tài)，比如，乙烯處理番茄可以通過(guò)上調(diào)SlACS2、SlACS4和下調(diào)SlACS6的轉(zhuǎn)錄來(lái)正向或負(fù)向調(diào)節(jié)乙烯的生物合成[24]。果實(shí)內(nèi)ABA的生物合成是否也存在這種調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。