任晴雯，安立昆，姚有華，姚曉華，劉凡語，吳昆侖

(1.青海大學(xué)，西寧 810016；2.青海省農(nóng)林科學(xué)院，西寧 810016；3.青海省青稞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家麥類改良中心青海青稞分中心，西寧 810016)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)，是青藏高原地區(qū)最重要的糧食和飼料作物之一，是高原農(nóng)業(yè)文明的象征。長期的進(jìn)化和人工培育使得青稞適應(yīng)了高原地區(qū)高寒、貧瘠、干旱、強(qiáng)紫外線等極端惡劣氣候，是青藏高原海拔2800m以上地區(qū)唯一能正常生長的糧食作物，青稞的生產(chǎn)直接影響著藏區(qū)的糧食安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展[1-2]。磷元素是作物正常生長發(fā)育不可缺少的三大營養(yǎng)元素之一，對(duì)于作物生長發(fā)育、抗性、產(chǎn)量、品質(zhì)都有直接影響。土壤中的磷易與陽離子螯合形成難溶化合物，雖然很多土壤中富含磷元素，但是能夠供植物吸收利用的土壤有效磷的含量很低，這使得磷肥的利用效率遠(yuǎn)低于氮和鉀[3-4]。在中國大多數(shù)耕地中都普遍存在磷元素缺乏和作物磷利用率低的問題，而長期過量施用磷肥會(huì)引起更嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)生態(tài)災(zāi)難[5]。研究磷高效利用基因，提高作物對(duì)土壤中磷的利用率，是實(shí)現(xiàn)生態(tài)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一[6]。青稞的主要栽培地區(qū)大多地處高原，生態(tài)環(huán)境極為敏感脆弱，對(duì)過量化肥施用引起的生態(tài)環(huán)境問題更為敏感，尤其是青藏高原地處三江源頭在全國具有特殊的生態(tài)地位，青藏高原的農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境保護(hù)直接關(guān)系到青藏高原地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。近年來青藏高原地區(qū)開展以生態(tài)文明統(tǒng)領(lǐng)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)施化肥減量增效戰(zhàn)略?？寺『脱芯壳囡赘咝Ю孟嚓P(guān)基因?qū)ρ芯壳囡偷土讬C(jī)制以及利用分子育種技術(shù)培育耐低磷青稞品種具有重要意義，有助于減少化肥的施用，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。對(duì)促進(jìn)青藏高原地區(qū)乃至全國青稞栽培區(qū)域的生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

植物對(duì)磷的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)主要依靠磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來完成，植物中磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和低親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受低磷快速誘導(dǎo)特異性表達(dá)，低親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是組成性表達(dá)[7-9]。目前植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究主要集中在PHT1、PHT2、PHT3、PHO1和PHO2五大家族。植物體中磷從地下往地上的長距離運(yùn)輸主要依賴PHO1家族磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，PHO1是第一個(gè)被鑒定出能夠?qū)⒘讖闹参锲鞴倭鞒龅牧邹D(zhuǎn)運(yùn)蛋白，PHO1家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要在根中柱細(xì)胞中表達(dá)，負(fù)責(zé)將磷裝載到木質(zhì)部，還可以吸收磷進(jìn)入到細(xì)胞，在植物磷運(yùn)輸和磷動(dòng)態(tài)平衡過程中發(fā)揮著極為重要的作用[10-13]。Ma等[14]對(duì)水稻OsPHO1;2進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)OsPHO1;2介導(dǎo)苗期根和莖組織之間的磷轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)具有內(nèi)流和外排活性，并以外排活性為主，OsPHO1;2并不參與細(xì)胞內(nèi)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)過程，而是作為外運(yùn)蛋白將磷從細(xì)胞中釋放出來。目前，關(guān)于植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PHO1家族的研究主要集中在擬南芥和水稻等模式植物中，其他植物中的研究報(bào)道較少，尤其是青稞中尚未見研究報(bào)道。本研究從青稞‘昆侖14’中克隆得到磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HvnPHO1;2，對(duì)其基因結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子區(qū)域元件、該基因編碼蛋白的蛋白理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測分析，對(duì)其他植物中的同源蛋白序列進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析。此外還對(duì)其亞細(xì)胞定位和表達(dá)模式進(jìn)行了分析。關(guān)于青稞中磷吸收利用相關(guān)基因研究報(bào)道極少，克隆和研究青稞磷高效吸收利用相關(guān)基因?qū)ρ芯壳囡偷土讬C(jī)制以及利用分子育種技術(shù)培育耐低磷青稞品種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

青稞品種‘昆侖14’和本氏煙草(Nicotianabenthamiana)由青海省青稞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。DNA提取采用天根生化科技有限公司植物基因組DNA提取試劑盒DP305。KOD-FX高保真PCR酶和熒光定量PCR試劑盒TOYOBO THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(QPS-201)購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。TransZol Up Plus RNA提取試劑盒和PCR產(chǎn)物連接及cDNA合成試劑盒EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(AE301-03)購自全式金生物技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和KpnⅠ購自NEB公司。大腸桿菌感受態(tài)為自制DH5α感受態(tài)。引物合成和測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 青稞DNA提取和cDNA合成 青稞品種‘昆侖14’種植于青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院實(shí)驗(yàn)溫室內(nèi)。待其長至3葉期時(shí)，摘取葉片提取DNA和RNA。參照天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒DP305說明書提取青稞葉片基因組DNA，參照全式金生物技術(shù)有限公司TransZol Up Plus RNA提取試劑盒提取的RNA，并參照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix cDNA合成試劑盒合成 cDNA，所有樣品放于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) PCR引物參照表1。

表1 引物序列Table 1 The primers

1.2.3 青稞HvnPHO1;2基因克隆 在植物基因組數(shù)據(jù)庫Gramene(http://www.gramene.org/)中搜索獲得大麥HvPHO1;2(HORVU6Hr1G089130.12)基因信息，并根據(jù)HvPHO1;2基因和啟動(dòng)子區(qū)域序列設(shè)計(jì)引物，采用KOD-FX高保真PCR酶從青稞品種‘昆侖14’ cDNA中擴(kuò)增出青稞HvnPHO1;2基因片段，從DNA中擴(kuò)增出啟動(dòng)子區(qū)域片段。擴(kuò)增程序?yàn)椋?10× PCR緩沖液12.5 μL dNTP Mixture(25 mmol/L) 5.0 μL，正反向引物(20 μmol/L)各 1 μL，模板DNA 1.0 μL，KOD-FX酶(5 U/μL)0.5 μL， ddH2O 4.0 μL，共25 μL。以提取的青稞DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，68 ℃ 2.5 min，35個(gè)循環(huán)；4 ℃保存。反應(yīng)完畢，取5 μL PCR產(chǎn)物在含EB的10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下檢測。將PCR產(chǎn)物與pEASY-Blunt Cloning載體混合參照說明書進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆并送測序。

1.2.4 青稞HvnPHO1;2基因生物信息學(xué)分析 在植物基因組數(shù)據(jù)庫Gramene(http://www.gramene.org/)中獲得基因結(jié)構(gòu)信息。利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析啟動(dòng)子元件。利用蛋白理化性質(zhì)分析網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/)分析理化性質(zhì)。利用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析跨膜結(jié)構(gòu)。利用SignalP(http://www.Cbs.Dtu.Dk /services /SignalP/)分析蛋白信號(hào)肽。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)中分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行同源建模生成三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索得到擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtPHO1;2、大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)GmPHO1;2、水稻(OryzasativaL.)OsPHO1;2、玉米(ZeamaysL.)ZmPHO1;2、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)BdPHO1;2、番茄(Solanumlycopersicum)SlPHO1;2、甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)的蛋白序列，采用DNAMAN7.0與大麥和青稞HvnPHO1;2蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，并根據(jù)NCBI提供的蛋白信息分析保守結(jié)構(gòu)域和關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。在植物基因組數(shù)據(jù)庫Gramene(http://www.gramene.org/)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索得到二型花(Dichantheliumoligosanthes)DoPHO1;2、OsPHO1;2、蘿卜(Raphanussativus)RsPHO1;2、醉蝶花(Tarenayahassleriana)ThPHO1;2、橡膠樹(Heveabrasiliensis)HbPHO1;2、木薯(Manihotesculenta)MePHO1;2、麻瘋樹(Jatrophacurcas)JcPHO1;2、蓖麻(Ricinuscommunis)RcPHO1;2、毛果楊(Populustrichocarpa)PtPHO1;2、可可樹(Theobromacacao)TcPHO1;2、榴蓮(Duriozibethinus)DzPHO1;2、棉花(Gossypiumhirsutum)GhPHO1;2、木槿(Hibiscussyriacus)HsPHO1;2、茶(Camelliasinensis)CsPHO1;2、芝麻(Sesamumindicum)SiPHO1;2、煙草(NicotianatabacumL.)NtPHO1;2、野草莓(Fragariavescasubsp.vesca)FvPHO1;2、桃(Prunuspersica)PpPHO1;2、狹葉羽扇豆(Lupinusangustifolius)LaPHO1;2、花生(Arachisipaensis)AiPHO1;2、木豆(Cajanuscajan)CcPHO1;2、白菜型油菜(Brassicarapa)BrPHO1;2、蘆筍(Asparagusofficinalis)AoPHO1;2、小蘭嶼蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris)PePHO1;2、油棕(Elaeisguineensis)EgPHO1;2、海棗(Phoenixdactylifera)PdPHO1;2、山羊草(Aegilopstauschiisubsp.tauschii)AtsPHO1;2、羊黍(Panicumhallii)PhPHO1;2、高粱(Sorghumbicolor)SbPHO1;2以及HvnPHO1;2的蛋白序列輸入MEGA7中以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 亞細(xì)胞定位表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)HvnPHO1;2cDNA序列以及pBI221-GFP載體多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物(表1)，并在其正向和反向引物上分別加上XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，使用高保真酶KOD-FX擴(kuò)增該片段，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s， 56 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；4 ℃保存。反應(yīng)完畢，取 5 μL PCR產(chǎn)物在含EB的10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下檢測。用XbaⅠ和KpnI對(duì)pBI221-GFP載體及PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，37 ℃酶切5 h后回收片段后進(jìn)行混合，采用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)中。選取陽性克隆進(jìn)行測序。將構(gòu)建好的pBI221-HvPHO1;2::GFP載體通過凍融法轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌GV3101中，將制備好的菌液注射入煙草葉片中。放入溫度25 ℃，相對(duì)濕度60%，12 h光周期中培養(yǎng)2～3 d。將葉片剪成1 cm2大小，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 青稞HvnPHO1;2基因表達(dá)模式分析 將青稞‘昆侖14’種植于實(shí)驗(yàn)溫室中，于灌漿期時(shí)，分別取旗葉、根、莖稈、籽粒、分蘗節(jié)樣品，立即放于液氮中，-80 ℃保存以備用。每個(gè)樣品至少選取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分析不同部位中的HvnPHO1;2的表達(dá)情況。選取飽滿的青稞‘昆侖14’種子用84消毒液浸泡6 min后用清水沖洗5次，將種子放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中室溫下進(jìn)行萌發(fā)，5 d后選取長勢一致的幼苗固定于泡沫板中，每個(gè)泡沫板25株幼苗，放于黑色塑料盒(400 mm × 300 mm × 120 mm)中采用改良Hoagland’s培養(yǎng)液(1 mmol/L KH2PO4)進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)塑料盒5 L培養(yǎng)液。用空氣泵24 h向培養(yǎng)液中通入空氣，每3 d更換一次培養(yǎng)液，每天用1 mol/L KOH溶液穩(wěn)定pH為7.0。當(dāng)青稞生長至5葉期時(shí)，分別進(jìn)行低磷脅迫、NaCl脅迫、ABA、MeJA、生長素NAA處理。將培養(yǎng)液換為低磷改良Hoagland’s培養(yǎng)液(10 μmol/L KH2PO4)進(jìn)行低磷處理。采用含有200 mmol/L NaCl的改良Hoagland’s培養(yǎng)液對(duì)青稞幼苗進(jìn)行鹽脅迫處理。分別配制100 mol/L的ABA、MeJA、NAA溶液，每種溶液配置200 mL并加入 0.1% Tween-20對(duì)青稞植株葉片進(jìn)行均勻噴灑，對(duì)照組僅噴灑200 mL加有0.1% Tween-20的純水。以上處理都于0 h(對(duì)照)、6、12、24、48、 96 h時(shí)取葉片或根并立即放于液氮中，-80 ℃保存以備用。每個(gè)樣品至少選取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分析HvnPHO1;2在不同處理下的表達(dá)模式。

采用全式金TransZol Up Plus RNA提取試劑盒，提取青稞葉、根、莖稈、分蘗節(jié)樣品的總RNA。青稞籽粒采用天根生化科技有限公司多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(DP441)提取總RNA。根據(jù)HvnPHO1;2基因的cDNA序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表1)，內(nèi)參基因?yàn)?8SrRNA。以500 ng/μL cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。反應(yīng)體系為：正反向引物各1.0 μL，cDNA 2.0 μL，THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 10 μL，ddH2O 6.0 μL，共20 μL。每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)，Ct值取平均值。根據(jù)2-△△Ct算法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞 HvnPHO1;2基因和啟動(dòng)子區(qū)域序列克隆

通過PCR分別擴(kuò)增出片段大小為2 400 bp的基因片段和2 001 bp的啟動(dòng)子區(qū)域片段(圖1)。將擴(kuò)增得到的片段連接入載體pEASY-Blunt Cloning載體中采用M13引物進(jìn)行測序獲得青稞HvnPHO1;2基因和啟動(dòng)子區(qū)域片段。

2.2 青稞 HvnPHO1;2生物信息學(xué)分析

2.2.1 基因結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子功能元件預(yù)測分析 根據(jù)植物基因組數(shù)據(jù)庫Gramene(http://ensembl.gramene.org/genome_browser/index.html)中獲得的HvnPHO1;2(HORVU6Hr1G089130.12)的基因結(jié)構(gòu)，HvnPHO1;2所對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本含有15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子(圖2)。將克隆得到的HvnPHO1;2基因啟動(dòng)子區(qū)域序列輸入啟動(dòng)子元件分析網(wǎng)站PlantCARE中進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)除了啟動(dòng)子核心元件以外還具有大量關(guān)于植物激素、脫落酸、茉莉酸順式作用元件，此外還具有低溫響應(yīng)元件和種子特異性調(diào)控順式作用元件(表2)。

表2 青稞 HvnPHO1;2啟動(dòng)子區(qū)域元件分析Table 2 Structure of cis-acting elements in promoter region of HvnPHO1;2 gene

2.2.2 青稞HvnPHO1;2蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析 通過在線軟件ProtParam分析青稞HvnPHO1;2蛋白的理化性質(zhì)(表3)。該蛋白由799個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為90 365.42 u，總原子數(shù)為12 735，親水系數(shù)為-0.069屬于親水蛋白，理論等電點(diǎn)為9.33，不穩(wěn)定指數(shù)為40.18屬于不

表3 HvnPHO1;2蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析Table 3 Physical and chemical properties of HvnPHO1;2 protein

穩(wěn)定蛋白，脂溶性指數(shù)為87.08。通過在線軟件TMHMM Server v.2.0網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)對(duì)HvnPHO1;2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)HvnPHO1;2蛋白具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)(圖3)。采用在線軟件SignalP-5.0(http://www.Cbs.Dtu.Dk/services/SignalP/)對(duì)HvnPHO1;2進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)HvnPHO1;2不具有信號(hào)肽(圖4)。采用在線軟件SOPMA分析HvnPHO1;2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)該蛋白的α螺旋(Alpha helix)、延長鏈(Extended strand)、β轉(zhuǎn)角(Beta turn)、無規(guī)則卷曲(Random coil)分別占氨基酸總數(shù)的55.94%、8.14%、 3.13%、32.79%(圖5)。采用在線軟件Swiss-Model(https://swissmodel.expasy.org/)對(duì)青稞HvnPHO1;2蛋白進(jìn)行同源建模生成三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，其結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本一致 (圖6)。

2.2.3 HvnPHO1;2蛋白氨基酸序列對(duì)比和同源進(jìn)化分析 采用DNAMAN7.0將青稞HvnPHO1;2和大麥HvPHO1;2的蛋白序列與擬南芥AtPHO1;2、大豆GmPHO1;2、二穗短柄草BdPHO1;2、番茄SlPHO1;2、煙草NtPHO1;2、油菜BnPHO1;2、水稻OsPHO1;2、玉米ZmPHO1;2進(jìn)行蛋白序列對(duì)比。結(jié)果表明，蛋白都具有SPX和EXS結(jié)構(gòu)域，大麥HvPHO1;2和青稞HvnPHO1;2的蛋白序列完全一致(圖7)。將青稞HvnPHO1;2與36種物種同源蛋白序列輸入MEGA7中構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)進(jìn)化樹主要分為單子葉植物和雙子葉植物兩個(gè)分支，大麥HvPHO1;2和青稞HvnPHO1;2與山羊草AtsPHO1;2親緣關(guān)系最近(圖8)。

2.3 HvnPHO1;2亞細(xì)胞定位研究

將帶有載體pBI221- HvPHO1;2::GFP的農(nóng)桿菌GV3101注射入煙草葉片中，對(duì)Hvn PHO1;2進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)綠色熒光信號(hào)分布于細(xì)胞膜上，說明HvnPHO1;2定位于細(xì)胞膜上(圖9)。

2.4 HvnPHO1;2表達(dá)模式分析

采用qPCR分析HvnPHO1;2的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，在不同的器官中莖稈和籽粒中的表達(dá)量較高，其次是分蘗節(jié)和根(圖10-A)。低磷脅迫處理會(huì)明顯誘導(dǎo)青稞葉片和根中的HvnPHO1;2表達(dá)，葉片和根中HvnPHO1;2表達(dá)在第24 h后明顯增高，在低磷處理48 h之后葉片和根中的HvnPHO1;2的表達(dá)趨于穩(wěn)定(圖10-B)。NaCl處理也能誘導(dǎo)青稞葉片和根中HvnPHO1;2的表達(dá)(圖10-C)。不同植物激素處理發(fā)現(xiàn)脫落酸ABA、茉莉甲酯MeJA能夠誘導(dǎo)青稞葉片中HvnPHO1;2的表達(dá)，而生長素NAA處理下青稞葉片中HvnPHO1;2的表達(dá)并沒有出現(xiàn)明顯變化(圖10-D～F)。

3 討 論

PHO1磷轉(zhuǎn)運(yùn)體家族是植物體內(nèi)多種磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的重要成員，PHO1家族在將吸收入植物體內(nèi)的磷遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部分的過程中發(fā)揮著重要的作用，其功能缺失后會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)磷向植株頂端轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制，PHO1家族不僅存在于被子植物中，也廣泛分布于苔蘚、蕨類、裸子植物等其他高等植物中[15]。PHO1基因是從一個(gè)地上部分磷積累變少的擬南芥突變體中首次發(fā)現(xiàn)的，該突變體可以正常吸收磷進(jìn)入根部，但磷通過維管束向芽轉(zhuǎn)移的過程受到抑制，正常供磷條件下根部對(duì)磷的吸收與野生型差異不大，在低磷培養(yǎng)條件下突變體嫩枝上的磷含量減少到野生型水平的3%～10%[16]。Rouached等[17]對(duì)擬南芥PHO1;2、PHO1;4基因功能缺失突變體pho1;2、pho1;4進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)該擬南芥中磷元素?zé)o法被運(yùn)轉(zhuǎn)到植株頂端，地上梢部葉片嚴(yán)重缺磷，但臨近根部的組織依然正常，將水稻OsPHO1;2轉(zhuǎn)入pho1;2、pho1;4突變體中發(fā)現(xiàn)擬南芥恢復(fù)了正常。蔣亭亭[18]對(duì)水稻OsPHO1功能缺失突變體ospho1進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)ospho1對(duì)磷的吸收能力降低，磷由地下部分向上運(yùn)輸能力受阻，ospho1生長緩慢，植株矮小，地上部表現(xiàn)缺磷癥狀，與野生型相比ospho1的株高、分蘗、穗長、結(jié)實(shí)率與千粒質(zhì)量都明顯降低，但突變體種子長度增加，寬度降低。目前，關(guān)于植物磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PHO1家族的研究主要集中在擬南芥和水稻等模式植物中，其他植物中的研究報(bào)道較少，尤其是青稞中尚未見研究報(bào)道。

本研究克隆了青稞磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HvnPHO1;2基因和啟動(dòng)子區(qū)域序列，對(duì)其基因和蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并對(duì)其亞細(xì)胞定位和表達(dá)模式進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)青稞HvnPHO1;2基因具有15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子HvnPHO1;2為親水性不穩(wěn)定蛋白，具有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，不具有信號(hào)肽。啟動(dòng)子元件分析發(fā)現(xiàn)HvnPHO1;2啟動(dòng)子區(qū)域除了具有大量的TATA-box和CAAT-box啟動(dòng)子核心元件以外還具有大量的植物激素相關(guān)順式作用元件，其中有6個(gè)脫落酸ABA和10個(gè)茉莉酸JA相關(guān)的順式作用元件，說明HvnPHO1;2受脫落酸和茉莉酸的調(diào)控。一些研究也表明PHO1家族中一些成員會(huì)受脫落酸和茉莉酸強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，尤其是脫落酸引起的氣孔關(guān)閉需要保衛(wèi)細(xì)胞中特異表達(dá)PHO1，其具體原因和機(jī)制尚不清楚[19-20]。蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)青稞HvnPHO1;2和大麥HvPHO1;2蛋白序列完全一致，并且都具有N端的SPX結(jié)構(gòu)域和C端EXS的結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域是PHO1類蛋白的典型結(jié)構(gòu)域。通過與其他物種的同源蛋白序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)青稞HvnPHO1;2和大麥HvPHO1;2與山羊草AtsPHO1;2親緣關(guān)系最近。本研究進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)HvnPHO1;2定位于細(xì)胞膜上。葉思誠[9]對(duì)不同磷水平下兩個(gè)油茶無性系根系轉(zhuǎn)錄組分析從中篩選并克隆了PHO1基因家族中的CoPHO1-3進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)很可能定位在細(xì)胞膜上。Ma等[14]對(duì)水稻OsPHO1;2進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究也發(fā)現(xiàn)OsPHO1;2定位于細(xì)胞膜上。有研究表明同一植物中PHO1基因家族不同成員的表達(dá)模式差異極大[21]。本研究對(duì)HvnPHO1;2的表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)HvnPHO1;2在青稞莖稈和籽粒中表達(dá)量較高，并且受MeJA、ABA的誘導(dǎo)表達(dá)，這與其啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測到有種子特異性調(diào)控和大量MeJA、ABA相關(guān)的順式作用元件結(jié)果一致，雖然其啟動(dòng)子區(qū)域也預(yù)測到有1個(gè)生長素順式作用元件，但NAA處理并沒有誘導(dǎo)其表達(dá)。此外低磷和NaCl脅迫處理也可以明顯誘導(dǎo)HvnPHO1;2在青稞葉片和根中表達(dá)。崔維旭[22]克隆了森林草莓FvPHO1;H9并對(duì)其功能和表達(dá)模式進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)FvPHO1;H9在花和葉柄中表達(dá)量高，而在幼葉、老葉、根中表達(dá)量低，在果實(shí)發(fā)育的過程中果實(shí)內(nèi)FvPHO1;H9基因表達(dá)量不斷升高，低磷、干旱、低溫脅迫可以顯著誘導(dǎo)森林草莓根和葉中FvPHO1;H9表達(dá)，而赤霉素GA3和生長素IBA誘導(dǎo)效果不顯著，對(duì)FvPHO1;H9的RNAi干擾草莓株系進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FvPHO1;H9表達(dá)量下降的株系長勢明顯不及野生型，根、葉片、果實(shí)中的磷含量積累明顯下降。何玲莉[23]克隆了大豆14個(gè)GmPHO1基因家族成員GmPHO1H01～GmPHO1H14，對(duì)其分子進(jìn)化和功能分化進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，這些基因分布于7條染色體上，內(nèi)含子數(shù)目為12～15個(gè)不等，GmPHO1H01～GmPHO1H08在營養(yǎng)和生殖器官中均有表達(dá)，GmPHOIH02在種子發(fā)育過程中其表達(dá)量較高，認(rèn)為GmPHOIH02可能參與大豆種子發(fā)育過程，GmPHO1H09～GmPHO1H14主要在營養(yǎng)器官中表達(dá)，生殖器官中的表達(dá)量較低或不表達(dá)，其中GmPHO1H07受干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，GmPHO1H012和GmPHO1H014表達(dá)受干旱脅迫抑制，而鹽脅迫可以誘導(dǎo)其表達(dá)，認(rèn)為GmPHO1H07、GmPHO1H012、GmPHO1H014可能參與調(diào)控應(yīng)對(duì)脅迫反應(yīng)。綜合上述研究結(jié)果，PHO1家族磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物體內(nèi)不僅僅參與磷元素的轉(zhuǎn)運(yùn)，很可能具有其他的生理功能，本試驗(yàn)克隆了青稞HvnPHO1;2基因和其啟動(dòng)子區(qū)域序列并進(jìn)行了初步研究，為青稞中磷高效吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因研究提供了一定參考，關(guān)于其在青稞中的具體功能，有待于進(jìn)一步研究。