丁燕玲,王鵬飛,楊朝云,馬 應(yīng),師丹丹,史遠(yuǎn)剛,康曉龍

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

miRNA是一類長度為18～22nt的單鏈非編碼小分子RNA，主要通過種子序列與靶基因的3’UTR區(qū)特定序列互補(bǔ)結(jié)合，抑制靶基因表達(dá)或誘導(dǎo)使其降解，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體的生物學(xué)過程[1-2]。miRNA的功能一般都是負(fù)調(diào)控，但近期研究表明，miRNA同樣也可以促進(jìn)基因的表達(dá)[3-4]，這進(jìn)一步拓寬了人們對miRNA調(diào)控方式的認(rèn)知。肌肉的生長發(fā)育直接影響肉牛的產(chǎn)肉量和肉品質(zhì)，肌細(xì)胞的增殖分化是肌肉組織正常發(fā)育的指標(biāo)[5]，而miRNA是成肌細(xì)胞、骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化過程的重要調(diào)控因素[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-1、miR-133和miR-206是3個在肌肉中特異性表達(dá)的miRNAs，miR-l、miR-206可以促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化，而miR-133則促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖[8-10]。miR-378、miR-143能夠分別靶向POLA2和IGFBP5基因調(diào)節(jié)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化[11-12]；miR-133表達(dá)量的上調(diào)與巴什拜羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)換存在關(guān)聯(lián)性[13]；在小鼠骨骼肌組織中過表達(dá)miR-499，Tnni1基因表達(dá)量顯著上調(diào)，Tnni2基因表達(dá)顯著下調(diào)[14]；miR-127-3p通過直接靶向DDIT3基因/轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控免疫與能量代謝類基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞分化[15]。目前已鑒定出大量miRNAs通過調(diào)控相應(yīng)靶基因和信號通路而影響骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和成肌細(xì)胞的增殖分化，然而miR-615對肌肉發(fā)育的研究少有報(bào)道。

miRNA靶基因的預(yù)測與鑒定是開展相關(guān)miRNA功能研究的基礎(chǔ)。前期研究基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)挖掘秦川牛剩余采食量(Residual feed intake, RFI)相關(guān)RNA分子時，發(fā)現(xiàn)miR-615是秦川牛RFI相關(guān)關(guān)鍵miRNAs之一，且在高RFI組中表達(dá)量上調(diào)[16]。由此，筆者推測miR-615及其靶基因可能通過影響飼料消化吸收參與調(diào)控牛能量代謝過程，進(jìn)而調(diào)節(jié)肌肉的生長發(fā)育。因?yàn)榧∪饨M織是機(jī)體能量代謝及線粒體呼吸過程中的重要組織之一[17]，如轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)N-6多不飽和脂肪酸(N-6PUFA)轉(zhuǎn)化為N-3多不飽和脂肪酸(N-3PUFA)，顯著提高體內(nèi)N-3PUFA含量，肌組織和細(xì)胞中N-3PUFA水平的增加促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的氧化代謝和糖原合成，但是抑制了葡萄糖的有氧氧化和磷酸戊糖循環(huán)，同時線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)和呼吸鏈復(fù)合體活性也顯著降低，進(jìn)而抑制了氧化磷酸化生成ATP[18]。研究表明，miR-615是一種在真核哺乳動物中高度保守的miRNA，它不僅在胚胎發(fā)育過程中的成骨和血管形成中參與生長發(fā)育的調(diào)節(jié)，還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和遷移，充當(dāng)腫瘤抑制劑或腫瘤促進(jìn)劑[19]。在大鼠軟骨分化誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)中，miR-615-3p過度表達(dá)后相關(guān)基因的mRNA表達(dá)顯著降低，促進(jìn)軟骨形成的轉(zhuǎn)錄因子SOX9表達(dá)也顯著降低，從而抑制了大鼠的軟骨分化，而敲除miR-615-3p則得到相反的結(jié)果。這表明miR-615-3p抑制軟骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，并可能抑制軟骨細(xì)胞分化[20]。在人類肝組織[21]、前列腺癌細(xì)胞[22]以及胰腺癌細(xì)胞[23]中，miR-615-5p通過抑制相應(yīng)基因的表達(dá)或信號通路而抑制癌細(xì)胞增殖、遷移，但其在肌肉發(fā)育過程中的功能尚不明確。因此，為研究miR-615在牛肌肉發(fā)育過程中的潛在作用與功能，利用已有數(shù)據(jù)庫對牛miR-615的靶基因進(jìn)行預(yù)測，并對其基因本體(Gene ontology,GO)和信號通路(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)進(jìn)行富集分析；之后采用qRT-PCR法分析miR-615在牛主要機(jī)體組織中的表達(dá)模式，初步了解miR-615可能參與的生物學(xué)調(diào)控途徑及潛在功能，為進(jìn)一步開展miR-615在牛肌肉發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 miR-615在不同物種間的保守性分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索出牛miR-615的序列，并與人(Homosapiens, has)、獼猴(Macacamulatta, mml)、小鼠(Musmusculus, mmu)、馬(Equuscaballu, eca)、猩猩(Pongopygmaeus, ppy)、犬(Canisfamiliaris, cfa)等11個物種的miR-615序列進(jìn)行比對，分析其在各物種間的保守性。

1.2 miR-615靶基因預(yù)測及功能富集分析

為了降低miR-615靶基因預(yù)測結(jié)果的假陽性，采用TargetScan、miRWalk和miRDB 3個在線軟件預(yù)測miR-615的靶基因，用軟件Veney繪制韋恩圖，得到3個數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果的交集， 然后集合miRTarbase數(shù)據(jù)庫中經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證的靶基因組成下一步分析的基因集合；通過DAVID數(shù)據(jù)庫對預(yù)測到的miR-615靶基因集合進(jìn)行GO、KEGG富集分析，以P<0.05為顯著性閾值。所用數(shù)據(jù)庫見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫名稱及網(wǎng)址Table 1 Name database and website

1.3 miR-615在牛各組織中的表達(dá)量分析

1.3.1 試驗(yàn)材料 選取寧夏某養(yǎng)殖場健康狀況良好、16月齡左右、體質(zhì)量相近的3頭秦川公牛為試驗(yàn)對象，屠宰后采集心、肝、脾、肺、腎等8個組織，帶回實(shí)驗(yàn)室，置-80 ℃冰箱保存，備用。

1.3.2 試驗(yàn)試劑 根據(jù)天根生化科技(北京)有限公司RNA試劑盒說明書提取各組織RNA，分光光度計(jì)檢測RNA濃度和純度，檢測合格后備用。反轉(zhuǎn)試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)購自TakaRa公司，熒光定量試劑盒(ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3.3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 提取心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、背最長肌、皮下脂肪等8個組織的總RNA，按照反轉(zhuǎn)試劑盒進(jìn)行cDNA合成，miRNA定量所需cDNA的反應(yīng)總體系20 μL：第一步反應(yīng)為5 g DNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，總RNA 2 μL，RNase Free ddH2O 5 μL， 42 ℃水浴2 min。第二步反應(yīng)：上一步混合物 10 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，miR-615莖環(huán)引物1 μL，5xPrimeScript Buffer 2 4 μL，RNase Free ddH2O 4 μL。反應(yīng)程序：50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；反應(yīng)結(jié)束后，所得cDNA -20 ℃保存，備用。

1.3.4 miR-615組織表達(dá)分析 根據(jù)miR-615成熟體序列，設(shè)計(jì)上、下游及莖環(huán)引物，以18S為內(nèi)參基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，詳細(xì)信息見表2。采用qRT-PCR法檢測 miR-615在心、肝、脾、肺、腎、瘤胃、背最長肌、皮下脂肪等8個組織中的表達(dá)量。反應(yīng)體系：2xChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，Primer F 0.8 μL，Primer R 0.8 μL，cDNA模板2 μL，RNase Free ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，56.5 ℃退火 30 s，共40個循環(huán)。每個樣品做3個重復(fù)，以2-ΔΔCT法計(jì)算相對表達(dá)量，數(shù)據(jù)用SAS 8.2軟件進(jìn)行 分析。

表2 miR-615定量引物信息Table 2 miR-615 quantitative primer information

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-615序列保守性分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索出牛miR-615的序列，并與人、獼猴、小鼠、馬、猩猩、犬等11個物種的miR-615序列進(jìn)行比對分析。結(jié)果表明(圖1)，不同物種之間的保守序列存在著一定差異，但Motif 1 在所涉及的物種間是共同的保守區(qū)域(圖1-A)，在對該區(qū)域進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn)(圖1-B)，該保守區(qū)域細(xì)胞定位于nucleus，主要參與蛋白質(zhì)結(jié)合及轉(zhuǎn)錄等過程。牛miR-615保守區(qū)域2和3也主要富集到轉(zhuǎn)錄過程，表明miR-615的主要功能是參與遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄過程，這與miRNA集合到靶位點(diǎn)從而影響靶基因轉(zhuǎn)錄的功能相一致。

2.2 miR-615靶基因預(yù)測結(jié)果

利用TargetScan、miRWalk和miRDB軟件分別預(yù)測到2 903、14 254和288個miR-615的靶基因，取三者的交集，獲得108個共有靶基因，其中miRTarbase數(shù)據(jù)庫中經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證的靶基因有35個，合并后共得到139個基因集合用于后續(xù)功能富集分析(圖2，表3)。

表3 miR-615的靶基因統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of miR-615 target genes

2.3 miR-615靶基因集合的GO分析

針對139個靶基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有29個GO條目，其中15個GO條目屬于生物學(xué)過程(Biological process，BP)，靶基因富集程度最高的GO條目有RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控及鈣離子調(diào)節(jié)的神經(jīng)遞質(zhì)胞吐等；4個GO條目分布在細(xì)胞組分(Cell components，CC)，其中在細(xì)胞內(nèi)膜和細(xì)胞質(zhì)富集的基因最多；10個GO條目為分子功能(Molecular function，MF)，靶基因顯著富集在RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子與DNA的特異性結(jié)合、GTP酶激活劑的活性、組蛋白去甲基酶活性(H3-K27特異性)等條目中(P<0.05)(表4)。

表4 miR-615潛在靶基因的GO注釋Table 4 GO annotations of miR-615 predicted target genes

2.4 miR-615靶基因集合的KEGG分析

經(jīng)KEGG富集通路分析，miR-615的靶基因顯著富集于PI3K-AKT和MAPK信號通路 (P<0.05)(表5)，以上通路在肌肉生長發(fā)育、脂肪沉積、能量代謝過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。其他富集通路盡管未達(dá)到顯著性水平，但也多與肌肉發(fā)育及能量代謝等過程密切關(guān)聯(lián)，如STIM1是定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白，它的主要功能是介導(dǎo)受體依賴型的鈣離子內(nèi)流，而鈣離子作為第二信使能直接與Ras-GTP結(jié)合并顯著增加Ras信號通路的活性[24]。研究發(fā)現(xiàn)STIM1的表達(dá)可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，從而增加成骨細(xì)胞的數(shù)量，在MC3T3-E1細(xì)胞沉默STIM1的表達(dá)后，明顯抑制鈣離子依賴的Ras信號通路的活性 (P<0.05)，成骨細(xì)胞會出現(xiàn)增殖抑制現(xiàn)象[25]。

表5 miR-615潛在靶基因KEGG通路富集分析Table 5 KEGG pathway enrichment analysis of target gene predicted by miR-615

2.5 牛miR-615的組織表達(dá)鑒定

采用莖環(huán)熒光定量PCR方法檢測牛各組織中miR-615的表達(dá)，由圖3可知，miR-615在皮下脂肪中的表達(dá)量最高，其次是背最長??；miR-615在背最長肌和心臟組織中的表達(dá)差異不顯著 (P>0.05)，但在皮下脂肪中的表達(dá)量顯著高于背最長肌和心臟組織(P<0.05)。在其他組織中miR-615均呈現(xiàn)低表達(dá)模式，且各組織間表達(dá)差異不顯著(P>0.05)。上述結(jié)果提示，牛miR-615可能通過機(jī)體脂肪代謝及肌肉活動過程發(fā)揮重要生物學(xué)功能，但詳細(xì)機(jī)制需進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行佐證。

3 討 論

胰島素樣生長因子2(Insulin-like growth factor 2，IGF2)是一種胎兒生長分化因子，在肌肉生長和成肌細(xì)胞增殖分化中起重要作用[26]，高表達(dá)IGF2時，可以促進(jìn)肌肉的形成，而當(dāng)IGF2基因被抑制時，則阻礙肌肉生成[27]。IGF2基因是miR-615的預(yù)測靶基因，大量研究證明IGF2基因在肌肉生長發(fā)育中起著極其重要的作用，它可以與肌肉發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子作用從而調(diào)控其過程[28]。牛IGF2基因定位于 29 號染色體，由 10 個外顯子組成，該染色體包含牛的產(chǎn)肉、產(chǎn)奶和健康性狀的數(shù)量性狀位點(diǎn)[29-30]。研究發(fā)現(xiàn)秦川牛IGF2基因內(nèi)含子3序列中 3 106 bp 位置附近的序列是轉(zhuǎn)錄因子ZBED6在牛基因組上的結(jié)合位點(diǎn)，干擾ZBED6后，對IGF2基因的表達(dá)具有明顯抑制作用，從而阻礙了肌肉的生成；而過表達(dá)后則促進(jìn)IGF2基因表達(dá)，并加快肌肉的生長發(fā)育[31]。本試驗(yàn)所得結(jié)果中IGF2是miR-615 的靶基因之一，牛 miR-615是否通過IGF2基因調(diào)控肌肉的生長發(fā)育目前仍不明確，IGF2 也將是后續(xù)開展試驗(yàn)驗(yàn)證的關(guān)鍵候選靶基因之一。

對 miR-615 靶基因集合進(jìn)行 KEGG 富集分析，發(fā)現(xiàn)靶基因集顯著富集于PI3K-AKT信號通路，該通路是細(xì)胞周期過程中非常重要的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，其通過影響下游分子的活化狀態(tài)維持細(xì)胞的凋亡和增殖[32]。PI3K是脂質(zhì)激酶家族成員，通過磷脂酰肌醇(PI)的特異性催化3-羥基磷酸化[33]；AKT是絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K途徑的中心介質(zhì)，在許多細(xì)胞過程中起關(guān)鍵作用，包括葡萄糖代謝，細(xì)胞凋亡、增殖和遷移[34]。蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)(Thr308)和絲氨酸磷酸化位點(diǎn)(Ser473)發(fā)生磷酸化后激活A(yù)KT蛋白，激活后的AKT直接磷酸化其底物雷帕霉素靶體蛋白(mTOR)，從而使其被激活。大量研究表明，PI3K-AKT-mTOR信號通路對骨骼肌的生長、存活和分化至關(guān)重要[35]。葡萄糖調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白94(GRP94)對早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要，上調(diào)GRP94可使PI3K-AKT-mTOR信號通路中PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平降低，從而抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路，但可使C2C12細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子MyoG的表達(dá)水平升高，表明GRP94可通過抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路而促進(jìn)肌肉分化[36]。此外，MSCs是骨髓中存在的一類具有強(qiáng)大增殖能力和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，能定向分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞等，在MSCs成骨誘導(dǎo)分化過程中，加入PI3K特異性抑制劑LY294002后，明顯抑制AKT的磷酸化，從而抑制MSCs的生長，提示PI3K-AKT信號通路在MSCs成骨誘導(dǎo)分化中起正調(diào)節(jié)作用[37]。但miR-615是否通過靶向GRP94基因來調(diào)節(jié)PI3K-AKT-mTOR信號通路，并調(diào)控牛肌細(xì)胞的增殖分化有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

MAPK信號通路是本試驗(yàn)通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)的靶基因顯著富集的通路(P<0.05)，該通路由細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、c-Jun N-末端激酶(JNK)和p38絲裂原激活蛋白激酶(p38-MAPK)3 個家族成員組成，這些通路是肌肉發(fā)育、脂肪生成的主要細(xì)胞內(nèi)信號通路之一[38]，該通路可能受一些上游因素的影響，或者影響下游因素，或直接影響脂肪因子、脂肪細(xì)胞分化基因的表達(dá)[39]。參與MAPK信號傳導(dǎo)的基因主要包括MAP3K5、MAP2K3和MAP2K2[40]。研究發(fā)現(xiàn)MAP3K5基因?qū)π笄軷FI性狀具有重要的調(diào)控作用，該基因不僅是生長及采食特征相關(guān)的候選基因，同時也與胚胎發(fā)育、肌肉發(fā)生、脂肪形成以及細(xì)胞免疫等密切關(guān)聯(lián)[41]，當(dāng)敲除或突變MAP3K5基因后，H2O2誘導(dǎo)的JNK活性受到抑制，進(jìn)而抑制c-JNK N末端激酶和p38-MAPK激酶觸發(fā)凋亡激酶級聯(lián)反應(yīng)，使得宿主細(xì)胞的分化凋亡、胃排空速率及食物利用效率顯著下降[42]，即脂肪代謝效率下降，脂肪在機(jī)體內(nèi)儲存，最終導(dǎo)致人和家畜肥胖；而肌肉中脂肪的含量與肉的風(fēng)味、嫩度和多汁性存在密切聯(lián)系，因此MAPK信號通路(尤其MAP3K5基因)可能在牛肌肉生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。MSCs是一種自我更新和分化的干細(xì)胞，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)或骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP-4)誘導(dǎo)的MSCs具有顯著的成骨傾向[43-44]，是骨折愈合過程中的關(guān)鍵細(xì)胞之一。有研究發(fā)現(xiàn)，負(fù)壓傷口治療(NPWT)通過MAPK途徑促進(jìn)MSCs的增殖和成骨分化，當(dāng)ERK、P38和JNK通路受到抑制時，成骨細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)降低，細(xì)胞的增殖能力下降，從而NPWT受到抑制[45]；p38通路的抑制降低了BMP4誘導(dǎo)的MSCs的成骨能力，而在多能干細(xì)胞C2C12成肌細(xì)胞系中，BMP-2可激活ERK和p38[46]。過度運(yùn)動會導(dǎo)致氧化應(yīng)激引起肌肉的炎癥反應(yīng)，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是一種抗炎分子，PPARγ通過抑制分化的C2C12細(xì)胞中ERK、p38-MAPK信號通路和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)從胞漿向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)，顯示出抗炎和抗氧化雙重作用，從而保護(hù)肌肉纖維[47]。由此推測miR-615可能通過靶向MAPK通路中MAP3K5、PPARγ等基因影響肌肉發(fā)育。

4 結(jié) 論

本文對牛miR-615靶基因及生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測分析，并鑒定miR-615在牛主要組織中的表達(dá)模式。結(jié)果表明miR-615可能通過潛在靶基因IGF2、GRP94和PPARγ等直接或間接參與肌肉發(fā)育相關(guān)的MAPK和PI3K-AKT信號通路，進(jìn)而調(diào)控牛成肌細(xì)胞增殖和分化，但這一推斷仍需后續(xù)的試驗(yàn)驗(yàn)證。