劉勝桃 宋鴿 王秀艷 李慧娟 常建軍 王宏

摘 要：目的：研究一種可行、適用、準確的霉菌檢測培養(yǎng)方法，來解決培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基干裂、環(huán)境污染、菌落計數(shù)不準確的問題。方法：對膜包裹法、培養(yǎng)盒法、直接培養(yǎng)法3種方法進行比較，來評價3種方法的可行性、適用性和準確性。結果：采用直接培養(yǎng)法培養(yǎng)的空白和樣品出現(xiàn)較大程度的污染及干裂現(xiàn)象，膜包裹法、培養(yǎng)盒法培養(yǎng)的樣品未造成污染，培養(yǎng)基未干裂不影響菌落計數(shù)。結論：采用隔離的方法能夠有效控制培養(yǎng)基干裂和污染的問題，提高菌落計數(shù)的準確性，同時可避免霉菌孢子在培養(yǎng)、觀察過程中擴散到環(huán)境中，造成污染，培養(yǎng)盒法較膜包裹法更方便、快捷、易觀察，是實驗室值得推廣的培養(yǎng)方法。

關鍵詞：霉菌;污染;干裂;隔離;培養(yǎng)

霉菌是絲狀真菌的統(tǒng)稱，廣泛分布于土壤、水、空氣等自然環(huán)境中[1-3]，因此食品極易被霉菌污染[4]。霉菌可引起食品、農產品的發(fā)霉變質，霉菌毒素可導致慢性中毒具有致癌、致畸、致突變作用[5]，可對人體健康造成危害[6-12]。霉菌的監(jiān)測也成為食品檢驗技術與食品衛(wèi)生質量評價中的重要組成部分[13-16]，我國先后5次修訂了食品中霉菌計數(shù)的方法標準[17-21]，據(jù)此我國各級監(jiān)督檢測機構全面開展食品中霉菌的檢測工作，自《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母菌計數(shù)》（GB 4789.15—2016）實施以來將原標準中倒置平板培養(yǎng)改成正置平板培養(yǎng)，霉菌培養(yǎng)中的污染和培養(yǎng)基干裂現(xiàn)象頻發(fā)，這主要是因為霉菌菌落可產生數(shù)量巨大的孢子，同時霉菌的孢子具有小、輕、干、多、休眠期長和抗逆性強等特點，任何一個孢子在適宜條件下都能發(fā)展成新的個體。常規(guī)霉菌檢測的培養(yǎng)過程中，以及觀察移動過程中，不可避免地造成空氣流動，霉菌孢子可趁機飄散進入空氣中并隨處散播、繁殖，引起嚴重的交叉污染和外部侵染[22]。又因霉菌的培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中水分損失較大，即使加大了培養(yǎng)基的傾注量，也無法避免培養(yǎng)基干裂，從而導致影響菌落計數(shù)的問題，而目前這兩項常見且棘手的問題始終困擾著相關人員，且無有效的控制

措施。

本實驗室在日常霉菌檢測中采取兩種隔離培養(yǎng)方法，即膜包裹法、培養(yǎng)盒法，對霉菌孢子擴散、污染及培養(yǎng)基干裂的控制效果顯著，且成本低廉，操作簡便，對比《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》（GB 4789.15—2016）（以下簡稱國標法）的計數(shù)結果，探討霉菌檢測過程中隔離式培養(yǎng)方法的可行性、實用性和準確性[23-27]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

霉菌和酵母質控樣（QC-FD-020），來自中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心;霉菌和酵母質控樣（A062018M），來自北京美正檢測技術有限公司。

1.1.2 試劑

孟加拉紅瓊脂，CM164，北京陸橋技術服務有限公司。

1.1.3 耗材

霉菌培養(yǎng)盒，食品級PVC材質，分為4個凹槽，凹槽與培養(yǎng)皿直徑及高度相匹配，每個凹槽有3個透氣孔，培養(yǎng)過程中形成有氧培養(yǎng)環(huán)境，此裝置為一次性使用，計數(shù)后的培養(yǎng)皿連同裝置一同高壓滅菌處理即可;保鮮膜或封口膜。

1.2 儀器與設備

BSC-1300IIB2生物安全柜（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）;SSW-600-2S恒溫水箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）;MJX-250BⅢ霉菌培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;MSⅢ basic漩渦混合器（德國IKA）。

1.3 實驗方法

1.3.1 膜包裹培養(yǎng)法

稱取25 g樣品加入225 mL無菌生理鹽水中，充分振搖，制成1∶10樣品勻液，取1∶10樣品勻液1 mL，加入含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，旋渦混勻，制成1∶100的樣品勻液，同時做空白對照，及時傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，在潔凈室中將平皿4～6個疊放，外層包裹保鮮膜或封口膜，在疊放的皿與皿之間用刀劃上長約2 cm的透氣孔，每層劃2～3個透氣孔，正置平板，置（28±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時以直接培養(yǎng)法的樣品作為對照，觀察并記錄培養(yǎng)至第5 d的結果。

1.3.2 霉菌盒培養(yǎng)法

稱取25 g樣品加入225 mL無菌生理鹽水中，充分振搖，制成1∶10樣品勻液，取1∶10樣品勻液1 mL，加入含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，旋渦混勻，制成1∶100的樣品勻液，同時做空白對照，及時傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后將平皿正置于霉菌盒中，每個槽可放置一個培養(yǎng)皿，將上蓋蓋嚴即可放入（28±1）℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，同時以直接培養(yǎng)法的樣品做對照，觀察并記錄培養(yǎng)至第5 d的結果。

1.3.3 直接培養(yǎng)法

稱取25 g樣品加入225 mL無菌生理鹽水中，充分振搖，制成1∶10樣品勻液，取1∶10樣品勻液1 mL，加入含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，旋渦混勻，制成1∶100的樣品勻液，同時做空白對照，及時傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，正置平板，置（28±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時以直接培養(yǎng)法的樣品作對照，觀察并記錄培養(yǎng)至第5 d的結果。

2 結果與分析

2.1 膜包裹培養(yǎng)法、霉菌盒培養(yǎng)法與直接培養(yǎng)法結果比較

對8組不同類型的樣品（已知不含菌樣品）進行霉菌檢測，同時監(jiān)控5組空白實驗，每組樣品每個稀釋度均進行兩組平行檢測，用膜包裹培養(yǎng)法和霉菌盒裝置培養(yǎng)的8組實驗樣品及5組空白對照，均未出現(xiàn)污染、培養(yǎng)基干裂的情況，同時使用菌片法進行檢驗驗證結果一致。而采用直接法培養(yǎng)的13組樣品，10組樣品出現(xiàn)不同程度的污染，部分培養(yǎng)基干裂，樣品污染情況占比69%，培養(yǎng)基干裂數(shù)量占

比77%。

實驗結果表明，膜包裹培養(yǎng)法和霉菌盒裝置培養(yǎng)法均可將環(huán)境中的污染來源完全隔離，且可以保證在較長的培養(yǎng)時間內降低培養(yǎng)基水分的損失。但霉菌盒裝置在結果觀察過程無需打開培養(yǎng)盒，可直接透過培養(yǎng)盒清晰地對菌落進行觀察計數(shù)，達到從樣品培養(yǎng)到出具結果，最終到廢棄物處理環(huán)節(jié)，培養(yǎng)物與外界環(huán)境始終保證有效的隔離，避免了環(huán)境、樣品、人員相互污染的風險。膜包裹培養(yǎng)法、霉菌盒正置培養(yǎng)法與直接法培養(yǎng)結果如表1所示。

2.2 膜包裹培養(yǎng)法、霉菌盒培養(yǎng)法準確性測試

使用膜包裹培養(yǎng)法及霉菌盒培養(yǎng)法對6組不同特性區(qū)間及不同廠家的霉菌質控樣品進行檢測，每組樣品、每個稀釋度均進行兩組平行檢測，檢測結果均在質控樣品特性區(qū)間，將膜包裹培養(yǎng)法得到的結果與霉菌盒培養(yǎng)法得到的結果配對T檢驗，P=0.18>0.05，表明無顯著性差異;培養(yǎng)過程中未出現(xiàn)培養(yǎng)基干裂及污染的現(xiàn)象，空白對照均無菌落生長，證明了兩種隔離培養(yǎng)方式不會對霉菌的生長產生影響，如表2所示。

3 結論與討論

本研究通過對膜包裹法、霉菌盒培養(yǎng)法、直接培養(yǎng)法培養(yǎng)過程進行比較，發(fā)現(xiàn)膜包裹法、霉菌盒培養(yǎng)法可有效解決在培養(yǎng)過程中水分流失造成的培養(yǎng)基干裂問題，且無污染，同時對質控樣品檢測發(fā)現(xiàn)上述兩種隔離培養(yǎng)方式不影響菌落計數(shù)，不影響霉菌的生長。因膜包裹法觀察過程中需要將膜拆開，而霉菌盒培養(yǎng)法較膜包裹法的優(yōu)勢在于在觀察和計數(shù)過程中不需要打開霉菌盒裝置，透過裝置可清晰對菌落進行觀察計數(shù)，從平板培養(yǎng)到最終廢棄物處置，培養(yǎng)物與外界環(huán)境始終保證有效的隔離措施，避免了環(huán)境、樣品、人員相互污染的風險。操作方便、成本低廉，霉菌培養(yǎng)盒也可應用于培養(yǎng)時間較長和（或）溫度較高的微生物檢測項目，例如嗜熱需氧芽孢檢測等，是實驗室值得推廣的培養(yǎng)方法。

參考文獻

[1]WANG X，WU Q H，WAN D，et al.Fumonisins： oxidative stress-mediated toxicity and metabolism in vivo and in vitro[J].Archives of Toxicology，2016，90（1）：81-101.

[2]BHAT R，REDDY K R N.Challenges and issues concerning mycotoxins contamination in oil seeds and their edible oils： Updates from last decade[J].Food Chemistry，2017，215：425-437.

[3]侯佳琪，王璐，何苗，等.糕點中霉菌的檢驗和控制[J].食品安全導刊，2017（24）：93.

[4]韓濤，楊雪妮，張芳.霉菌檢測中封閉式培養(yǎng)方法的建立和應用[J].食品科學，2019，40（16）：308-313.

[5]張晨夕，韓陽，陳丹丹.紙張中霉菌檢測方法研究[J].黑龍江造紙，2019（2）：18-24.

[6]董曼佳，楊其亞，孫偉，等.拮抗酵母菌控制玉米赤霉烯酮的研究進展[J].食品科學，2016，37（1）：230-234.

[7]LIN P F，CHEN F L，SUN J，et al.Mycotoxin zearalenone induces apoptosis in mouse Leydig cells via an endoplasmic reticulum stress-dependent signalling pathway[J].Reproductive toxicology，2015，52：71-77.

[8]GAO W，JIANG L P，GE L，et al.Sterigmatocystin-induced oxidative DNA damage in human liver-derived cell line through lysosomal damage[J].Toxicology in vitro，2015，29（1）：1-7.

[9]MCKEAGUE M，BRADLEY C R，DE GIROLAMO A，et al.Screening and initial binding assessment of fumonisin B1 aptamers[J].International Journal of Molecular Sciences，2010，11（12）：4864-4881.

[10]IQBAL S Z，JINAP S，PIROUZ A A，et al.Aflatoxin M1 in milk and dairy products， occurrence and recent challenges： a review[J].Trends in Food Science & Technology，2015，29（1）：1-7.

[11]CARVAJAL-MORENO M.Metabolic changes of aflatoxin B1 to become an active carcinogen and the control of this toxin[J].Immunome Research，2015，11（3）：2-14.

[12]SELVARAJ J N，WANG Y，ZHOU L，et al.Recent mycotoxin survey data and advanced mycotoxin detection techniques reported from China： a review.[J].Food Additives and Contaminants-Part A Chemistry，Analysis，Control，Exposure and Risk Assessment，2015，32（4）：440-452.

[13]韋尚偉.食品檢驗技術中存在的問題[J].現(xiàn)代食品，2017（5）：61-63.

[14]鄒軍.我國食品檢驗技術中存在問題及解決方法探析[J].科技創(chuàng)新與應用，2016（8）：297.

[15]陳平燕.我國食品檢驗技術中存在的問題探析[J].廣東蠶業(yè)，2017，51（10）：94-95.

[16]高景會.食品安全檢測中存在的問題及解決對策[J].現(xiàn)代食品，2017（8）：12-13.

[17]中華人民共和國衛(wèi)生部.食品衛(wèi)生微生物學檢驗 霉菌和酵母數(shù)測定：GB/T 4789.15—1984[S].北京：中國標準出版社，1984.

[18]中華人民共和國衛(wèi)生部.食品衛(wèi)生微生物學檢驗 霉菌和酵母數(shù)計數(shù)：GB/T 4789.15—1994[S].北京：中國標準出版社，1994.

[19]中華人民共和國衛(wèi)生部.食品衛(wèi)生微生物學檢驗 霉菌和酵母數(shù)計數(shù)：GB/T 4789.15—2003[S].北京：中國標準出版社，2003.

[20]中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù)：GB 4789.15—2010[S].北京：中國標準出版社，2010.

[21]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù)：GB 4789.15—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[22]劉永永，紀丹，劉曉海，等.生化培養(yǎng)箱內部的循環(huán)風向對霉菌檢測結果的影響[J].食品安全質量檢測學報，2020，11（1）：262-268.

[23]李若旦才讓.提高食品檢驗準確性的措施[J].食品安全導刊，2016（18）：33.

[24]陳創(chuàng)輝.食品檢驗結果的影響因素及提高檢驗結果準確性的措施[J].食品安全導刊，2018（18）：57.

[25]陳杰.科學做好食品安全檢驗檢測工作[J].中國食品，2018（6）：68-70.

[26]徐慧萍，李翠霞.我國乳品質量安全的影響因素分析[J].中國食物與營養(yǎng)，2012，18（8）：5-8.

[27]郭利亞，王加啟，李發(fā)弟.淺析我國生鮮乳質量安全監(jiān)管及對策[J].中國畜牧雜志，2012，48（12）：42-45.