王慧敏 李靜波 王俊杰 陳文明 蔡紀(jì)堂

(河南省中醫(yī)院耳鼻喉科，河南 鄭州 450000)

喉癌屬于頭頸部惡性腫瘤，隨著環(huán)境污染及生活節(jié)奏的加快導(dǎo)致喉癌發(fā)病率逐年增加，其主要病理類型為喉鱗狀細(xì)胞癌，目前臨床主要采用手術(shù)、放療及化療等方式治療喉癌，雖有一定治療效果，但仍有大部分患者仍發(fā)生復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移而降低治療效果〔1,2〕。由于喉癌患者早期癥狀較為隱匿，導(dǎo)致早期診斷準(zhǔn)確率較低，大部分患者就診時已處于進(jìn)展期，導(dǎo)致患者預(yù)后差，已有研究表明飲食不健康、吸煙等均可能誘發(fā)喉癌〔3〕。中醫(yī)藥抗癌已成為研究熱點(diǎn)，研究表明部分中醫(yī)藥可有效治療喉癌，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未完全闡明〔4〕。因而基于喉癌發(fā)病機(jī)制積極尋找治療喉癌的新型中藥對提高治療效果及臨床合理用藥均有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)金線蓮對宮頸癌、結(jié)腸癌、喉癌的生長增殖有一定的抑制作用〔5〕。但金線蓮黃酮對喉癌增殖等生物行為的影響及其機(jī)制目前還未有研究。Raf1激酶抑制蛋白(RKIP)在下咽癌下調(diào)表達(dá)，RKIP低表達(dá)可促進(jìn)下咽癌發(fā)生轉(zhuǎn)移〔6〕。相關(guān)研究報(bào)道指出RKIP可能通過下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)進(jìn)而抑制喉鱗癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移〔7〕。但有關(guān)金線蓮黃酮是否通過調(diào)控RKIP表達(dá)而殺傷喉鱗癌細(xì)胞的內(nèi)在機(jī)制尚未見報(bào)道。因此，本研究旨在探討金線蓮黃酮對喉鱗癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，初步分析其是否可通過調(diào)控RKIP表達(dá)而發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 喉癌Hep-2細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫。金線蓮購自福建漳州且經(jīng)屬性鑒定為蘭科開唇蘭屬植物福建金線蓮，精密稱取1 g金線蓮，全株剪碎，磨成汁液，水浴提取，過濾，按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行操作〔8〕，測定吸光度，計(jì)算金線蓮中總黃酮含量。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清與胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；siRNA-RKIP及其陰性對照均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測試劑盒購自美國Amresco公司；Transwell小室與Matrigel基質(zhì)膠均購自北京樂博生物科技有限公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；蛋白裂解液與BCA蛋白定量試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人RKIP多克隆抗體、兔抗人p21、CyclinD1抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗均購自美國CST公司；兔抗人E-cadherin抗體購自美國BD公司；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、藥物處理及分組 喉癌Hep-2細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后置于含有10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/ml，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨機(jī)分為對照組、金線蓮黃酮(0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 mg/ml)組〔9〕，每組均設(shè)置6個復(fù)孔。為驗(yàn)證RKIP過表達(dá)對喉癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，分別將RKIP過表達(dá)載體及空載體分別轉(zhuǎn)染入喉癌Hep-2細(xì)胞，分別為pcDNA3.1-RKIP組、pcDNA3.1組。另將siRNA-RKIP及其陰性對照分別轉(zhuǎn)染入喉癌Hep-2細(xì)胞12 h，加入濃度為0.16 mg/ml的金線蓮黃酮處理48 h，分別為金線蓮黃酮0.16 mg/ml+si-RKIP組、金線蓮0.16 mg/ml+si-NC組，目的是驗(yàn)證金線蓮黃酮是否通過調(diào)控RKIP表達(dá)進(jìn)而影響喉癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲過程，轉(zhuǎn)染步驟均嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.2MTT檢測細(xì)胞增殖 收集對數(shù)生長期喉癌Hep-2細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/ml，收集細(xì)胞后以每孔5×104個細(xì)胞的密度接種于96孔板，每組均設(shè)置3個復(fù)孔，分別于轉(zhuǎn)染或處理后的24 h、48 h、72 h時，加入20 μl MTT溶液，放入恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，低速振蕩混勻20 min，利用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm處各孔吸光度(OD)值。

1.2.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 用不含血清的DMEM培養(yǎng)基200 μl稀釋各組喉癌Hep-2細(xì)胞，細(xì)胞密度為1×105/ml，取200 μl細(xì)胞稀釋液放入Transwell小室上室，取含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基600 μl加入Transwell小室下室，置于37℃、5%CO2體積分?jǐn)?shù)、相對濕度95%的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，棉簽擦拭Transwell小室聚碳酸酯膜表面細(xì)胞，多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色15 min，置于顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取5個視野計(jì)算遷移細(xì)胞個數(shù)。

1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲 取各組對數(shù)生長期喉癌Hep-2細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液(2×105/ml)，預(yù)備實(shí)驗(yàn)：使用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠，取100 μl稀釋液包被Transwell小室底部的上室面，Transwell小室上室內(nèi)加入200 μl細(xì)胞懸浮液，Transwell小室下室內(nèi)加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，棉簽擦拭Transwell小室上室表面細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次×5 min，多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色15 min，置于顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取5個視野計(jì)算侵襲細(xì)胞個數(shù)。

1.2.5qRT-PCR檢測細(xì)胞中RKIP mRNA表達(dá)水平 收集各組喉癌Hep-2細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度，選取A260/A280≥1.8的RNA樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成模板鏈cDNA，采用qRT-PCR法檢測RKIP mRNA相對表達(dá)量，qRT-PCR條件為95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)40次。每個樣品均設(shè)置3個復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計(jì)算RKIP mRNA相對表達(dá)量。

1.2.6Western印跡檢測RKIP、E-cadherin、P21、CyclinD1、MMP-2蛋白表達(dá) 收集各組喉癌Hep-2細(xì)胞，加入蛋白裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取30 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫條件下5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入各蛋白一抗，TBST洗滌，分別加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌，ECL顯影，利用凝膠分析系統(tǒng)及Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1金線蓮黃酮對細(xì)胞Hep-2增殖的影響 與對照組相比，金線蓮黃酮0.04 mg/ml組、金線蓮黃酮0.08 mg/ml組、金線蓮黃酮0.16 mg/ml組、金線蓮黃酮0.32 mg/ml組、金線蓮黃酮0.64 mg/ml組喉癌Hep-2細(xì)胞增殖活性均顯著降低，CyclinD1蛋白水平顯著降低，而p21蛋白水平顯著升高且呈劑量依賴性(均P<0.05)，見表1、圖1。表明金線蓮黃酮可明顯抑制喉癌Hep-2細(xì)胞增殖。選用48 h時喉癌Hep-2細(xì)胞增殖活性約為50%的金線蓮黃酮濃度(0.16 mg/ml)做后續(xù)使用。

表1 金線蓮黃酮對細(xì)胞Hep-2增殖的影響

1～6:對照組；金錢蓮黃酮0.04 mg/ml組;金錢蓮黃酮0.08 mg/ml組;金錢蓮黃酮0.16 mg/ml組;金錢蓮黃酮0.32 mg/ml組;金錢蓮黃酮0.64 mg/ml組圖1 金線蓮黃酮對細(xì)胞Hep-2增殖蛋白表達(dá)的影響

2.2金線蓮黃酮對細(xì)胞Hep-2遷移、侵襲的影響 與對照組相比，金線蓮黃酮0.16 mg/ml組喉癌Hep-2細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)目均顯著減少(P<0.001)，金線蓮黃酮0.16 mg/ml組喉癌Hep-2細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.001)，而MMP-2表達(dá)水平顯著低于對照組(P<0.001)，見圖2、表2、圖3。表明金線蓮黃酮可明顯抑制喉癌Hep-2細(xì)胞遷移及侵襲。

圖2 金線蓮黃酮對細(xì)胞Hep-2遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

圖3 金線蓮黃酮對細(xì)胞Hep-2遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

2.3金線蓮黃酮對細(xì)胞Hep-2中RKIP表達(dá)的影響 與對照組相比，金線蓮黃酮0.16 mg/ml組喉癌Hep-2細(xì)胞中RKIP mRNA及蛋白水平均顯著升高(P<0.001)，見圖4、表2。

表2 金線蓮黃酮對細(xì)胞Hep-2遷移、侵襲、PKIP表達(dá)的影響

圖4 金線蓮黃酮對細(xì)胞Hep-2中RKIP蛋白表達(dá)的影響

2.4過表達(dá)RKIP對細(xì)胞Hep-2增殖、遷移、侵襲的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-RKIP組喉癌Hep-2細(xì)胞中RKIP蛋白水平顯著升高(P<0.001)，提示轉(zhuǎn)染效果良好。同pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-RKIP組喉癌Hep-2細(xì)胞活性顯著降低(P<0.001)，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)目均顯著減少(P<0.001)，E-cadherin、p21蛋白水平均顯著升高(P<0.001)，而CyclinD1、MMP-2蛋白水平均顯著降低(P<0.001)，見表3、圖5。

表3 過表達(dá)RKIP對細(xì)胞Hep-2增殖、遷移、侵襲的影響

圖5 過表達(dá)RKIP對細(xì)胞Hep-2增殖、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

2.5抑制RKIP表達(dá)能逆轉(zhuǎn)金線蓮黃酮對細(xì)胞Hep-2增殖的作用 與金線蓮黃酮0.16 mg/ml+si-NC組相比，金線蓮黃酮0.16 mg/ml+si-RKIP組喉癌Hep-2細(xì)胞活性顯著升高(P<0.001)，CyclinD1蛋白水平顯著升高(P<0.001)，而p21蛋白水平顯著降低(P<0.001)，見圖6、表4。

1、2：金線蓮黃酮0.16 mg/ml+si-NC組;金線蓮黃酮0.16 mg/ml+si-RKIP組；圖7同圖6 抑制RKIP表達(dá)能逆轉(zhuǎn)金線蓮黃酮對細(xì)胞Hep-2增殖蛋白表達(dá)的影響

表4 抑制RKIP表達(dá)能逆轉(zhuǎn)金線蓮黃酮對細(xì)胞Hep-2增殖、遷移及侵襲的抑制作用

2.6抑制RKIP表達(dá)能逆轉(zhuǎn)金線蓮黃酮對細(xì)胞Hep-2遷移、侵襲的作用 與金線蓮黃酮0.16 mg/ml+si-NC組相比，金線蓮黃酮0.16 mg/ml+si-RKIP組喉癌Hep-2細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)目均顯著增加(P<0.001)，MMP-2蛋白水平顯著升高(P<0.001)，而E-cadherin、PKIP蛋白水平顯著降低(P<0.001)，見表4、圖7。

圖7 抑制RKIP表達(dá)能逆轉(zhuǎn)金線蓮黃酮對細(xì)胞Hep-2遷移、侵襲蛋白的影響

3 討 論

頭頸部惡性腫瘤中喉癌的發(fā)病率相對較高，目前臨床治療手段?？蓳p傷正常組織干細(xì)胞增殖活性而引發(fā)胃腸道不良反應(yīng)，嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量甚至影響治療效果〔10～12〕?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對中醫(yī)藥治療癌癥的研究進(jìn)展取得較大突破，因此探究中醫(yī)藥治療喉癌的作用機(jī)制對抗腫瘤新藥研發(fā)及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

金線蓮有滋陰降火、消炎止痛及清涼解毒等功效，對高血壓、腎炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等均有較好治療效果〔13〕。研究報(bào)道指出金線蓮中多種活性成分可用于治療多種惡性腫瘤，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未完全闡明〔14〕。金線蓮的多糖成分可通過干擾肺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞周期而抑制腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用〔15〕。金線蓮的揮發(fā)油成分可通過引發(fā)線粒體凋亡途徑進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡〔16〕。已有研究報(bào)道指出細(xì)胞周期改變、細(xì)胞凋亡減少及遷移能力增強(qiáng)均可促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展，CyclinD1可正向調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，而p21可通過抑制CyclinD1與相關(guān)蛋白結(jié)合進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲的主要因素之一，E-cadherin表達(dá)上調(diào)預(yù)示EMT過程發(fā)生逆轉(zhuǎn)，可抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移，細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白MMP-2可明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲〔17,18〕。說明金線蓮黃酮可通過抑制喉鱗癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲進(jìn)而影響腫瘤惡性進(jìn)展。提示金線蓮黃酮可能通過誘導(dǎo)EMT進(jìn)程進(jìn)而抑制喉鱗癌細(xì)胞遷移及侵襲。

RKIP屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族成員，其可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子-核因子(NF)-κB及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號通路進(jìn)而影響細(xì)胞增殖及分化過程，研究表明RKIP屬于抑癌基因且在腫瘤組織及細(xì)胞系中均呈低表達(dá)，RKIP低表達(dá)可影響腫瘤細(xì)胞穩(wěn)定性進(jìn)而增加細(xì)胞遷移及侵襲〔19〕。研究表明RKIP表達(dá)水平降低與鼻咽癌細(xì)胞遷移及侵襲密切相關(guān)，其可能通過激活NF-κB信號通路進(jìn)而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞遷移及侵襲〔20〕。RKIP過表達(dá)可明顯抑制前列腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移〔21〕。本研究結(jié)果提示金線蓮黃酮可能通過上調(diào)RKIP表達(dá)而減弱喉癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力；金線蓮黃酮可通過上調(diào)RKIP表達(dá)進(jìn)而降低喉癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。

綜上，金線蓮黃酮有抑制喉鱗癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用，其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)RKIP表達(dá)而影響相關(guān)基因及蛋白表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，可為臨床應(yīng)用金線蓮黃酮治療喉鱗癌提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但關(guān)于金線蓮黃酮對RKIP基因上游調(diào)控基因及其相關(guān)信號通路的調(diào)控作用仍需深入研究。