白燕 郭英 余宏鑫 王正煜 龐秋菊 賀凡 周慶元

(三二〇一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 漢中 723000)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常見的組織學(xué)類型，約占肺癌總數(shù)的80%，其中約75%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于中晚期，是威脅人類健康的重大疾病之一，目前尚缺乏根治方法，5年生存率很低〔1,2〕。因此闡明NSCLC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，對(duì)改善非NSCLC的診斷方法和提高治療效果意義重大。miRNA是一類內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA分子，通過與靶基因的3′UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔3～5〕。研究表明，miR-634在宮頸癌組織表達(dá)水平顯著低于正常組織，miR-634可通過抑制mTOR的表達(dá)來(lái)抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲〔6〕；miR-634在肝癌組織和細(xì)胞中均為低表達(dá)，上調(diào)其水平可抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲并誘導(dǎo)其凋亡〔7〕；miR-634在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)下調(diào)，LncRNA DANCR在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)升高，干擾 DANCR的表達(dá)調(diào)控miR-634的表達(dá)上調(diào)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖〔8〕。但miR-634在NSCLC細(xì)胞的增殖、凋亡的影響和具體分子機(jī)制目前還未見報(bào)道，因此本課題就miR-634在NSCLC中的表達(dá)情況及其對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖、凋亡的影響和其具體機(jī)制展開研究，以期為NSCLC的早期診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料 正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B和NSCLCA549、H1299、H1650細(xì)胞購(gòu)自中科院上海生化細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清購(gòu)自Gibco；1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自Sigma；LipofectamineTM2000、Trizol總RNA抽提試劑購(gòu)自Invitrogen；熒光定量試劑盒購(gòu)自Roche；Western印跡用兔抗人CDCA5抗體購(gòu)自Sigma Aldrich；CCK-8試劑購(gòu)自Amresco；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%FBS、 160萬(wàn)U慶大霉素/ml的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，并置于37℃、5%CO2、pH值7.2～7.4的無(wú)菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)時(shí)PCR 根據(jù)Trizol法抽提總RNA,催化逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，運(yùn)用熒光定量qPCR試劑盒在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)細(xì)胞中miR-634和CDCA5 mRNA的表達(dá)水平。miR-634引物為：上游5′-CCUUCAAUUUGACCGUCCU-3′，下游5′-AAUAAAACCAGGUCGAAUAGGU-3′；CDCA5引物為：上游5′-CCAGCCA G AAGTTAAAGG-3′，下游5′-AAGCCACCAACAGAAGG-3′；以U6為內(nèi)參，引物為：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，60℃ 5 s，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)。所得結(jié)果直接在熒光定量操作系統(tǒng)進(jìn)行比較分析，目標(biāo)基因的相對(duì)定量用2-ΔΔCT計(jì)算。

1.2.3Western印跡法檢測(cè)蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白并采用二喹啉甲酸(BAC)法測(cè)定蛋白濃度。各組蛋白上樣后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入1抗并搖床4℃孵育過夜，TBST洗滌2次，每次6 min，后加入相應(yīng)二抗并室溫孵育1 h，TBST洗滌2次，每次6 min，進(jìn)行熒光顯色10 min。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NSCLC A549細(xì)胞，用胰酶消化，接種于6孔板上，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí)，按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書將過表達(dá)miR-634的模擬物及其miR陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，分別標(biāo)記為miR-634組和miR-NC組。轉(zhuǎn)染4 h后，更換含血清的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞并采用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將A549細(xì)胞隨機(jī)分為si-CDCA5組(轉(zhuǎn)染沉默CDCA5的siRNA)、si-NC組(轉(zhuǎn)染沉默CDCA5的陰性對(duì)照)、anti-miR-634組(轉(zhuǎn)染干擾miR-634的模擬物)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染干擾miR-634的陰性對(duì)照)、miR-634+pcDNA-CDCA5組(miR-634模擬物與pcDNA-CDCA5真核載體共轉(zhuǎn)染)、miR-634+pcDNA組(miR-634模擬物與pcDNA空載體共轉(zhuǎn)染)6組，采用上述方法轉(zhuǎn)染后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖 按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞每孔接種于96孔板，各組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，放在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞密度長(zhǎng)到50%～60%，每孔加入10 μl CCK溶液，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24 h、48 h、72 h時(shí)檢測(cè)490 nm處吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡 收集各組待測(cè)細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞種植于6孔板，根據(jù)AnnexinV-FITC試劑盒處理細(xì)胞，簡(jiǎn)要步驟如下：用緩沖液重懸細(xì)胞，輕搖至均勻避光孵育15 min，加入適量AnnexinV-FITC，避光條件下孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。

1.2.7雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn) 采用TargetScan(http://www.targetscan.org/ )靶基因預(yù)測(cè)庫(kù)預(yù)測(cè)到miR-634與CDCA5存在結(jié)合位點(diǎn)。猜測(cè)miR-634可能是CDCA5的一個(gè)靶基因。為驗(yàn)證這一猜想，構(gòu)建野生型WT-CDCA5和突變型MUT-CDCA5的熒光素酶報(bào)告載體。參照1.2.4方法LipofectamineTM2000將miR-NC和miR-634分別與WT-CDCA5和MUT-CDCA5共轉(zhuǎn)染，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h。收集各組細(xì)胞，參照雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1NSCLC中miR-634、CDCA5的表達(dá) 與正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞相比,NSCLC A549、H1299、H1650細(xì)胞中miR-634表達(dá)水平均顯著下降，CDCA5 mRNA和蛋白的表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 CDCA5蛋白在NSCLC和正常肺上皮細(xì)胞中的表達(dá)

表1 檢測(cè)NSCLC和正常肺上皮細(xì)胞中miR-634和CDCA5的表達(dá)

2.2過表達(dá)miR-634抑制NSCLC A549細(xì)胞的增殖 與miR-NC組相比，miR-634組NSCLC miR-634表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，成功構(gòu)建了miR-634過表達(dá)的A549細(xì)胞。與miR-NC組相比，miR-634組細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1表達(dá)量顯著下降，p21和p27蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.05)；轉(zhuǎn)染24 h后，miR-634Z組細(xì)胞活性較miR-NC組顯著下降(P<0.05)，見表2，圖2?？梢妋iR-634對(duì)NSCLC A549細(xì)胞的增殖具有抑制作用。

表2 過表達(dá)miR-634對(duì)NSCLC A549細(xì)胞增殖及相關(guān)增殖蛋白的影響

圖2 miR-634過表達(dá)對(duì)NSCLCA549細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3過表達(dá)miR-634促進(jìn)NSCLCA549細(xì)胞的凋亡 miR-634組凋亡率較miR-NC組顯著上升(P<0.05)，凋亡相關(guān)蛋白B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2表達(dá)量顯著下降，Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)和酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，可見過表達(dá)miR-634對(duì)肺癌A549細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用。見圖3，圖4，表3。

圖3 細(xì)胞凋亡流式圖

圖4 miR-634過表達(dá)對(duì)NSCLC A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 過表達(dá)miR-634對(duì)NSCLC A549細(xì)胞的凋亡及其相關(guān)蛋白的影響

2.4沉默CDCA5表達(dá)抑制NSCLC A549細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其細(xì)胞凋亡 與si-NC組相比，si-CDCA5組CDCA5蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，表明成功構(gòu)建了沉默CDCA5表達(dá)的A549細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，CDCA5組細(xì)胞活性無(wú)顯著差異(P>0.05)，轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，si-CDCA5組細(xì)胞活性較si-NC組顯著下降(P<0.05)；si-CDCA5組較si-NC組CyclinD1蛋白表達(dá)量明顯降低，p21蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.05)，可見沉默CDCA5的表達(dá)抑制了肺癌細(xì)胞的增殖。與si-NC組相比，si-CDCA5組細(xì)胞凋亡率顯著上升，Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯下降，Bax蛋白表達(dá)量明顯上升(均P<0.05)，可見抑制沉默CDCA5的表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞的凋亡。見表4，圖5。

圖5 沉默CDCA5的表達(dá)對(duì)NSCLCA549細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表4 沉默CDCA5的表達(dá)對(duì)NSCLC A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.5miR-634可靶向抑制CDCA5的表達(dá) TargetScan(http://www.targetscan.org/ )軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明miR-634和CDCA5之間存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，見圖6。與miR-NC與WT-CDCA5共轉(zhuǎn)染相比，miR-634與WT-CDCA5共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低，但miR-NC、miR-634分別與miR-CDCA5共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)明顯變化(P<0.05)，見表5，可見miR-634對(duì)CDCA5具有靶向作用。與miR-NC組CDCA5蛋白(0.67±0.06)相比，miR-634組(0.29±0.03)顯著下降(P<0.05)，anti-miR-634組CDCA5蛋白表達(dá)量(0.98±0.09)較anti-miR-NC組(0.63±0.06)顯著升高(P<0.05)，見圖7，可見miR-634可負(fù)向調(diào)控CDCA5的表達(dá)。

圖7 Western印跡檢測(cè)CDCA5的表達(dá)

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖6 miR-634與CDCA5互補(bǔ)的核苷酸序列

2.6過表達(dá)CDCA5可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-634對(duì)NSCLCA549細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與miR-634+pcDNA組相比，miR-634+pcDNA-CDCA5組CDCA5、CyclinD1蛋白表達(dá)顯著上升，p21蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)；轉(zhuǎn)染48 h后，miR-634+pcDNA-CDCA5組較miR-634+pcDNA組細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)；與miR-634+pcDNA組相比，miR-634+pcDNA-CDCA5組Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯上升，Bax蛋白和細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)。見表6，圖8。可見過表達(dá)CDCA5能逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-634對(duì)NSCLCA549細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

表6 過表達(dá)CDCA5逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-634對(duì)NSCLC A549細(xì)胞增殖凋亡的影響

1～2:miR-634+pcDNA組,miR-634+pcDNA-CDCA5組圖8 過表達(dá)CDCA5逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-634對(duì)NSCLCA549細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

3 討 論

肺癌是當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，是我國(guó)發(fā)生率和死亡率最高的惡性腫瘤。NSCLC在肺癌的病理細(xì)胞學(xué)分析中最常見，由于NSCLC起病隱匿，初期癥狀無(wú)特異性，所以當(dāng)確診時(shí)多已經(jīng)出現(xiàn)局部或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而失去手術(shù)切除根治的機(jī)會(huì)〔9,10〕，且很多患者的癌細(xì)胞對(duì)放化療存在耐受性，因此，急需治療NSCLC的新方法來(lái)提高患者的遠(yuǎn)期生存率和改善患者的生活質(zhì)量。研究表明，miRNAs的異常表達(dá)與很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)〔11～13〕。miRNA可通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響癌癥的發(fā)展，并可作為預(yù)測(cè)癌癥發(fā)生發(fā)展的指標(biāo)〔14〕，故找到與癌癥相關(guān)的miRNAs及下游靶基因?qū)⒂欣诎┌Y的治療。研究發(fā)現(xiàn)，miR-634在宮頸癌、肝癌、膠質(zhì)瘤、胰腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，起到抑癌基因的作用〔15〕。CDCA5定位于人染色體11q13.1，確保有絲分裂后期姐妹染色單體準(zhǔn)確分離〔16〕。研究表明，CDCA5的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失去調(diào)控，并介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔17〕，Zhang等〔18〕發(fā)現(xiàn)CDCA5胃癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，下調(diào)其表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖；陳野圳〔19〕發(fā)現(xiàn)沉默CDCA5基因有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖；彭洪等〔20〕發(fā)現(xiàn)CDCA5在乳腺癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織，沉默CDCA5的表達(dá)能有效抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC的發(fā)生發(fā)展的過程中，CDCA5的表達(dá)逐漸升高〔21〕。本研究提示CDCA5是miR-634的下游靶基因。