孫定軍 梁中書 邢波 陳漠水 張福偉

(海口市人民醫(yī)院(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院)心血管內(nèi)科，海南 ?？?570208)

動脈粥樣硬化(AS)是一種常見病，其發(fā)病率呈逐年增長趨勢，對人類健康造成極大的威脅〔1〕。AS的發(fā)病機制十分復(fù)雜，是一個多因素、多階段的病理過程。研究表明，氧化應(yīng)激引起的血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)損傷、內(nèi)皮功能障礙等是AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié)，抑制內(nèi)皮細胞損傷對AS的治療尤為重要〔2，3〕。CRNDE是一種長鏈非編碼RNA(LncRNA)，與腫瘤等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，可作為疾病診斷的生物學(xué)標記物及治療的分子靶點〔4～6〕。研究顯示，CRNDE在脂多糖誘導(dǎo)的肺成纖維Wl-38細胞中表達上調(diào)，過表達CRNDE可明顯促進細胞凋亡及炎癥因子表達〔7〕。目前，CRNDE對血管內(nèi)皮細胞的影響還未知。生物信息學(xué)軟件顯示，CRNDE可能靶向結(jié)合miR-29a-3p。miR-29a-3p在腦卒中患者血清中表達下降，其表達降低可能減弱了對Kruppel樣因子(KLF)4表達的抑制作用，從而促進腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(IL)-10等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，加速AS進程〔8〕。本研究以建立氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞EVC-304損傷模型，探討了CRNDE對ox-LDL誘導(dǎo)的EVC-304細胞氧化應(yīng)激及凋亡的影響及其是否通過調(diào)控miR-29a-3p發(fā)揮作用，以期為AS的治療提供分子靶點。

1 材料與方法

1.1細胞和實驗試劑 EVC-304細胞系，中國科學(xué)院上海細胞所；胎牛血清，杭州四季青公司；DMEM培養(yǎng)基、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒，北京索萊寶；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，南京建成；B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體，美國Santa Cruz公司；Trizol試劑和LipofectamineTM2000試劑盒，美國Invitrogen公司；CRNDE小干擾RNA(si-CRNDE)、小干擾RNA陰性對照序列(si-NC)、miR-29a-3p模擬物(mimics)和抑制劑(anti-miR-29a-3p)、模擬對照物(miR-NC)及抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)、CRNDE突變型(MUT-CRNDE)熒光素酶載體和野生型(WT-CRNDE)熒光素酶載體，上海吉凱基因公司包裝合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇EVC-304細胞，加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞融合至90%左右時，胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.2qRT-PCR檢測CRNDE和miR-29a-3p表達量 將2.5 ml對數(shù)期EVC-304細胞(2.5×104個/ml)接種于6孔板中，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基，分為對照(Con)組和ox-LDL組。Con組、ox-LDL組細胞分別用含0、100 μg/ml〔9〕的ox-LDL培養(yǎng)24 h。然后收集細胞，Trizol試劑提取各組細胞中總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，行PCR。用 2-△△Ct法計算miR-29a-3p相對U6、CRNDE相對GAPDH的表達量。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 將2.5 ml對數(shù)期EVC-304細胞(2.5×104個/ml)接種于6孔板中，待細胞融合至60%時，更換無血清培養(yǎng)基。利用LipofectamineTM2000試劑盒，分別轉(zhuǎn)染si-CRNDE、si-NC、miR-29a-3p mimcs、miR-NC、共轉(zhuǎn)染si-CRNDE與anti-miR-29a-3p、si-CRNDE與anti-miR-NC至EVC-304細胞。轉(zhuǎn)染12 h后，更換為完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h，qRT-PCR檢測CRNDE或miR-29a-3p水平驗證轉(zhuǎn)染效果，方法同上述1.2.2，并收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測EVC-304細胞中MDA、SOD和GSH-Px水平 將2.5 ml上述1.2.3轉(zhuǎn)染后的細胞(2.5×104個/ml)均接種于6孔板中，培養(yǎng)4 h后，均用100 μg/ml ox-LDL作用24 h，依次標記為ox-LDL+si-CRNDE組、 ox-LDL+si-NC組、ox-LDL+miR-29a-3p組、ox-LDL+miR-NC組、 ox-LDL+si-CRNDE+anti-miR-29a-3p組、ox-LDL+si-CRNDE+anti-miR-NC組。同時接種未轉(zhuǎn)染的EVC-304細胞，按照上述1.2.2設(shè)置Con組和ox-LDL組。培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清液，胰酶消化，收集細胞。加細胞裂解液裂解細胞，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，分別利用MDA、SOD和GSH-Px試劑盒檢測上清液中其水平。

1.2.5流式細胞儀檢測EVC-304細胞凋亡 細胞分組和處理同1.2.4，培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細胞，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次。1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加500 μl結(jié)合緩沖液，重懸細胞。加10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min。再加5 μl PI，室溫避光孵育5 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6Western印跡法檢測蛋白表達 細胞分組和處理同1.2.4，培養(yǎng)結(jié)束后，收集各組細胞，用RIPA裂解液裂解細胞提取總蛋白，經(jīng)BCA試劑盒測定蛋白濃度后，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將分離蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，并用5%脫脂牛奶封閉2 h。于4℃冰箱中分別用Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗孵育過夜，洗膜后，用山羊抗兔二抗(1∶500)37℃孵育1 h。加顯影液，避光顯影，曝光拍照，Image J軟件分析目的蛋白相對GAPDH表達量。

1.2.7雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?將2.5 ml對數(shù)期EVC-304細胞(2.5×104個/ml)接種于6孔板中，待細胞融合至60%時，更換無血清培養(yǎng)基。利用LipofectamineTM2000試劑盒，分別將WT-CRNDE與miR-29a-3p mimic或miR-NC、CRNDE-MUT與miR-29a-3p mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染至EVC-304細胞。轉(zhuǎn)然12 h后，更換為完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h后，收集細胞。加細胞裂解液裂解細胞，4 500 r/min離心10 min，取上清液，利用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1CRNDE和miR-29a-3p在ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞中的表達 ox-LDL組血管內(nèi)皮細胞EVC-304中CRNDE表達量顯著高于Con組(P<0.05)，miR-29a-3p表達量顯著低于Con組(P<0.05)。見表1。

表1 CRNDE和miR-29a-3p在ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞中的表達

2.2沉默CRNDE表達對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激的影響 轉(zhuǎn)染si-NC、si-CRNDE的EVC-304細胞中CRNDE表達量分別為1.00±0.09、0.24±0.03，兩者比較差異顯著(t=24.033，P<0.05)，表明沉默CRNDE的EVC-304細胞構(gòu)建成功。與Con組比較，ox-LDL組MDA水平顯著升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px活力顯著降低(P<0.05)；與ox-LDL+si-NC組比較，ox-LDL+si-CRNDE組MDA水平顯著降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活力顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 沉默CRNDE表達對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激的影響

2.3沉默CRNDE表達對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響 ox-LDL組血管內(nèi)皮細胞EVC-304凋亡率、Bax蛋白表達量顯著高于Con組(P<0.05)，而Bcl-2蛋白量顯著低于Con組(P<0.05)；ox-LDL+si-CRNDE組血管內(nèi)皮細胞EVC-304凋亡率、Bax蛋白表達量顯著低于ox-LDL+si-NC組(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達量顯著高于ox-LDL+si-NC組(P<0.05)。見圖1、圖2、表3。

表3 表達對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響

1～4:Con組、ox-LDL組、ox-LDL+miR-NC組、ox-LDL+si-CRNDE組，圖3同圖1 凋亡相關(guān)蛋白表達

圖2 細胞凋亡流式圖

2.4miR-29a-3p過表達對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷的影響 轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-29a-3p miomics的EVC-304細胞中miR-29a-3p表達量分別為1.00±0.02、3.12±0.18，兩者比較差異顯著(t=35.117，P<0.05)，表明過表達miR-29a-3p 的EVC-304細胞構(gòu)建成功。ox-LDL+miR-29a-3p組EVC-304細胞中MDA含量、細胞凋亡率、Bax蛋白表達量均顯著低于ox-LDL+miR-NC組(P<0.05)，而SOD和GSH-Px活力、Bcl-2蛋白表達量均顯著高于ox-LDL+miR-NC組(P<0.05)。見表4和圖3。

表4 miR-29a-3p過表達對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷的影響

1～4：con組，ox-LDL組，ox-LDL+miR-NC組，ox-LDL+miR-29a-3p組圖3 Bcl-2、Bax凋亡相關(guān)蛋白表達

2.5CRNDE靶向調(diào)控miR-29a-3p的表達 生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示的CRNDE與miR-29a-3p的互補核苷酸序列見圖4。共轉(zhuǎn)染miR-29a-3p mimics與WT-CRNDE的EVC-304細胞熒光素酶活性低于共轉(zhuǎn)染miR-NC與WT-CRNDE的EVC-304細胞(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染miR-29a-3p mimics與MUT-CRNDE的EVC-304細胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染miR-NC與WT-CRNDE的EVC-304細胞比較無顯著差異(P>0.05)，見表5。轉(zhuǎn)染si-NC、si-CRNDE的EVC-304細胞中miR-29a-3p表達量分別為1.00±0.08、2.98±0.17，兩者比較差異顯著(t=31.615，P<0.05)。

圖4 CRNDE的序列中含有與miR-29a-3p互補的核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報告實驗

2.6抑制miR-29a-3p逆轉(zhuǎn)了沉默CRNDE表達對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷的作用 共轉(zhuǎn)染si-CRNDE+anti-miR-NC、si-CRNDE+anti-miR-29a-3p的EVC-304細胞中miR-29a-3p表達量分別為1.00±0.05、0.28±0.02，兩者比較差異顯著(t=40.110，P<0.05)，表明EVC-304細胞miR-29a-3p的表達受到抑制。ox-LDL+si-CRNDE+anti-miR-29a-3p 組EVC-304細胞中MDA含量、細胞凋亡率、Bax蛋白表達量均顯著高于ox-LDL+si-CRNDE+anti-miR-NC組(P<0.05)，而SOD和GSH-Px活力、Bcl-2蛋白表達量均顯著低于ox-LDL+si-CRNDE+anti-miR-NC組(P<0.05)。見圖5和表6。

1～4：ox-LDL+si-NC組、ox-LDL+si-CRNDE組、ox-LDL+si-CRNDE+anti-miR-NC組、ox-LDL+si-CRNDE+anti-miR-29a-3p組圖5 各組凋亡相關(guān)蛋白表達

表6 抑制miR-29a-3p逆轉(zhuǎn)了沉默CRNDE表達對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷的作用

3 討 論

血管內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激損傷在AS的發(fā)生中起重要作用，與高血壓、冠心病等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。MDA是細胞氧化損傷的代謝產(chǎn)物，其含量高低可反映細胞氧化損傷程度〔10〕。SOD時機體內(nèi)重要的氧自由基清除劑，可通過消除氧自由基對細胞的損傷，保護機體免受損害〔11〕。GSH-Px也是一種抗氧化酶，可清除活性氧，維持機體內(nèi)的氧化還原平衡，其活力降低說明機體內(nèi)存在氧化應(yīng)激反應(yīng)〔12〕。研究顯示，ox-LDL是引起血管內(nèi)皮細胞損傷的因素之一，可加速AS病變，常用于誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞建立損傷模型〔13〕。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞EVC-304后，EVC-304細胞MDA含量升高，SOD和GSH-Px活力降低，與相關(guān)研究結(jié)果一致〔14〕，表明ox-LDL刺激誘導(dǎo)EVC-304細胞產(chǎn)生了氧化應(yīng)激，細胞損傷。血管內(nèi)皮細胞凋亡也參與AS的發(fā)生和發(fā)展過程，降低內(nèi)皮細胞的凋亡對AS的治療有積極意義。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2參與調(diào)控細胞凋亡，Bax表達升高，細胞凋亡加劇，而Bcl-2表達升高，細胞凋亡減弱。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL誘導(dǎo)后，EVC-304細胞凋亡率增加，Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低，表明ox-LDL刺激可促進EVC-304細胞凋亡。

作為一種LncRNA，CRNDE參與多種疾病的發(fā)展進程。研究顯示，下調(diào)CRNDE表達可提高創(chuàng)傷性腦損傷模型大鼠的神經(jīng)行為功能，抑制炎癥因子的表達〔15〕；CRNDE在硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細胞系中表達升高，沉默CRNDE表達可通過上調(diào)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細胞凋亡〔16〕。目前，CRNDE對血管內(nèi)皮細胞的影響還未知。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL誘導(dǎo)EVC-304細胞后，細胞中CRNDE表達水平明顯升高，提示CRNDE參與血管內(nèi)皮細胞損傷。轉(zhuǎn)染CRNDE的小干擾RNA沉默CRNDE表達后，ox-LDL誘導(dǎo)的EVC-304細胞MDA含量降低，SOD和GSH-Px活力升高，說明沉默CRNDE表達可減輕ox-LDL誘導(dǎo)的EVC-304細胞氧化應(yīng)激損傷。此外，沉默CRNDE表達后，ox-LDL誘導(dǎo)的EVC-304細胞凋亡率和Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，說明沉默CRNDE表達可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的EVC-304細胞凋亡。

本研究證實了CRNDE在EVC-304細胞中靶向負調(diào)控miR-29a-3p表達。研究顯示，miR-29a-3p表達的抑制可通過靶向上調(diào)Bcl-2和髓樣細胞白血病(Mcl)-1等基因的表達促進小鼠巨噬細胞凋亡〔17〕；上調(diào)miR-29a-3p可抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激，減輕心肌缺血再灌注損傷〔18〕。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL可明顯降低EVC-304細胞中miR-29a-3p的表達，而過表達miR-29a-3p抑制了ox-LDL誘導(dǎo)EVC-304細胞凋亡，并減輕了細胞氧化應(yīng)激損傷，提示miR-29a-3p有可能成為AS治療的分子靶點。本研究還顯示，抑制miR-29a-3p表達逆轉(zhuǎn)了沉默CRNDE對ox-LDL誘導(dǎo)EVC-304細胞氧化應(yīng)激和凋亡的抑制作用，進一步說明沉默CRNDE表達可能通過靶向上調(diào)miR-29a-3p表達發(fā)揮作用。

綜上所述，CRNDE在ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞EVC-304中表達升高，沉默CRNDE抑制了ox-LDL誘導(dǎo)的EVC-304細胞氧化應(yīng)激和凋亡，保護細胞損傷，其作用機制與靶向上調(diào)miR-29a-3p表達有關(guān)，CRNDE/miR-29a-3p軸可能為AS的治療提供了分子靶點。