權(quán)興苗 宋春俠 范麗潔 徐立偉 劉玉蘭 王月

(1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，河北 承德 067000；2河北中醫(yī)學(xué)院)

圍絕經(jīng)期綜合征(PMS)主要發(fā)生于絕經(jīng)期女性患者，就診主訴多為五心煩熱，心悸失眠，煩躁易怒和心緒不寧，病情嚴(yán)重者可影響正常的生活和工作〔1,2〕。既往研究表明，祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)于PMS有一定的療效，二仙湯〔3〕和六味地黃丸〔4〕均可在一定程度上緩解PMS的臨床癥狀，但效果有限。平肝補(bǔ)腎方是最新興起的一種中醫(yī)藥治療方案。主要針對(duì)腎虛的主要癥狀，其以溫腎陽(yáng)，滋腎陰，瀉腎火為主，以適應(yīng)陰陽(yáng)俱虛于下的癥狀〔5,6〕。本研究以平肝補(bǔ)腎方為治療方案，構(gòu)建PMS細(xì)胞模型，觀察其對(duì)PMS治療效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 胎牛血清(FBS，BI公司，以色列)；DMEM培養(yǎng)液、AV-PI凋亡試劑盒及2.5 g/L胰酶Trypsin(Invitrogen公司，美國(guó))；Trizol及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司,日本)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)儀(Bio-Rad公司，美國(guó))；Transwell試劑盒及CCK-8試劑盒(北京碧云天公司，中國(guó))，以SPF級(jí)雌性離乳大小鼠30只為研究對(duì)象，體重(91.3±3.6)g，購(gòu)自山東省濟(jì)南市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心許可證書編號(hào)：〔SCXK(魯)2016-0893〕。

1.2方法

1.2.1PMS細(xì)胞模型的構(gòu)建〔7〕待雌性SD大鼠性成熟后，脫頸椎處死，放入盛有75%酒精的玻璃缸內(nèi)，浸泡2 min以消毒。取至無(wú)菌潔凈臺(tái)，解剖刀處理SD大鼠，在無(wú)菌的條件下，把卵巢及周圍附著的脂肪組織一并取出，迅速放入滅菌的25 cm2培養(yǎng)皿內(nèi)，然后在超凈臺(tái)內(nèi)用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗卵巢3次。解剖刀去除多余的脂肪、結(jié)締組織和輸卵管等附件，再次用含5%FBS的培養(yǎng)基沖洗1次，放入盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下用注射針頭刺破卵泡，輕輕擠壓，鋼篩過濾，1 500 r/min離心，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)；用0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，細(xì)胞活率為(91.98±7.99)%。同時(shí)利用Transwell試劑盒的上室和下室，以105個(gè)/cm2細(xì)胞數(shù)接種于Transwell試劑盒下室，進(jìn)而構(gòu)建PMS細(xì)胞模型。

1.2.2平肝補(bǔ)腎藥方配伍 方藥組成：柴胡15 g，玄參15 g，生地10 g，熟地10 g，郁金10 g，白芍15 g，知母10 g，梔子15 g，地骨皮15 g，青蒿20 g，丹皮12 g，五味子15 g，夜交藤30 g，浮小麥30 g，甘草10 g。所有藥物均經(jīng)水煎。取汁待用。

1.2.3細(xì)胞分組 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，將?gòu)建好的PMS細(xì)胞模型分成3組，即中藥組，細(xì)胞給予上述平肝補(bǔ)腎藥方處理，1 ml/孔，處理12 h；抑制劑組，即細(xì)胞在平肝補(bǔ)腎藥方處理的基礎(chǔ)上，增加細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)5的抑制劑BIX02188處理，12 μl/ml，處理12 h；空白對(duì)照組，細(xì)胞加入等量PBS。

1.3細(xì)胞功能學(xué)分析 3組細(xì)胞經(jīng)上述方法處理12 h后，利用胰蛋白酶進(jìn)行消化和收集，接種于96孔板中。按照CCK-8試劑盒說明書要求，加入各試劑，孵育30 min后，450 nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，之后每30 min檢測(cè)1次吸光度，直到4 h為止。按照AV-PI的試劑盒的說明書加入各試劑，流式細(xì)胞儀分析各組樣本，計(jì)算各組凋亡率。

1.4細(xì)胞靶分子的定量分析

1.4.1qPCR試劑盒檢測(cè)ERK5和凋亡因子表達(dá) 3組細(xì)胞經(jīng)上述方法處理12 h后，利用胰蛋白酶進(jìn)行消化和收集，加入1 ml Trizol 試劑，充分混合后，提取細(xì)胞總RNA，室溫條件下根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，配制20 μl的逆轉(zhuǎn)錄體系，加入總RNA，37℃水浴箱孵育30 min，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃低溫冰箱保存。然后根據(jù)qPCR試劑盒說明書，配制50 μl的qPCR體系，加入cDNA和ERK5，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-6和Caspase-3的引物模板，ERK5：正義鏈5'-CAUAAUAGACGGGACUAGAATA-3'，反義鏈5'-CCTGGCUGACUUGAAUAUGTT-3'；Caspase-3：正義鏈5'-TTGCTAGGTCCTGTCTTCAGATGA-3'，反義鏈5'-CCGATAAGCTCCGTTTCCTGGTTC-3'；Caspase-6：正義鏈5'-GTCGTATGCAGGTTTCGGTTGCTG-3'，反義鏈5'-TGTAAGCCGTGGCTCAATCCTCTC-3'；GAPDH：正義鏈5'-GCCTCTCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，反義鏈5'-AAGCTGCTGGTGAAGAGCCAGTGGA-3'。置于Applied Biosystems PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，設(shè)置條件按照說明書。統(tǒng)計(jì)并記錄個(gè)樣本CT值，利用2-△△CT的方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.2Western印跡檢測(cè)ERK5和凋亡因子表達(dá) 3組細(xì)胞經(jīng)上述方法處理12 h后，PBS清洗后，加入2 ml RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解和收集細(xì)胞碎片，加入PE管中，預(yù)冷高速離心機(jī)，4℃，12 000 r/min，收集總蛋白，加入10 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)，99℃煮沸，BAD試劑盒測(cè)定蛋白的分子量。按照說明書，配制10%分離膠和4%濃縮膠，加入50 ng蛋白量，1×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液浸沒膠板，40 V電泳2 h后轉(zhuǎn)染到硝酸纖維素膜，TBST洗膜后，過夜孵育ERK5，Caspase-3和Caspase-6的蛋白一抗，TBST液洗膜，常溫孵育鼠抗山羊辣根過氧化物酶(HRP)二抗30 min，DAB顯影，Image J 軟件分析蛋白條帶。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.13組細(xì)胞增殖能力比較 自第12小時(shí)起，中藥組細(xì)胞增殖率均明顯高于空白對(duì)照組，抑制劑組細(xì)胞增殖率均明顯低于空白對(duì)照組和中藥組(均P<0.05)，見表1。

表1 3組細(xì)胞的增殖率比較

2.23組細(xì)胞凋亡水平比較 中藥組凋亡率〔(1.13±0.35)%〕明顯低于空白對(duì)照組〔(5.13±0.91)%〕和抑制劑組〔(47.97±3.36)%，P<0.05〕；且抑制劑組凋亡率明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。

2.33組ERK5和凋亡因子Caspase-6和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平比較 3組ERK5 mRNA水平比較：中藥組>空白對(duì)照組>抑制劑組(均P<0.05)，3組Caspase-6和Caspase-3 mRNA水平比較：抑制劑組>空白對(duì)照組>中藥組(均P<0.05)。見表2。

表2 3組ERK5、Caspase-6、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.43組細(xì)胞ERK5和凋亡因子Caspase-6和Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 3組ERK5蛋白水平比較：中藥組>空白對(duì)照組>抑制劑組(均P<0.05)；3組Caspase-6、Caspase-3蛋白水平比較：抑制劑組>空白對(duì)照組>中藥組(均P<0.05)，見表3，圖1。

表3 3組ERK5、Caspase-6、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

1～3：中藥組,空白對(duì)照組，抑制劑組圖1 Western 印跡檢測(cè)Caspase-3、Caspase-6及ERK5蛋白表達(dá)

3 討 論

PMS往往與機(jī)體內(nèi)的激素水平改變相關(guān)。其主要癥狀為煩躁易怒，頭暈?zāi)垦５取?,9〕。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，19%～30%的PMS患者可影響正常的工作和生活，治療愿望迫切〔10〕。PMS主要與機(jī)體的激素水平相關(guān)，在絕經(jīng)期，機(jī)體的雌激素急劇下降，造成了卵巢在短時(shí)間內(nèi)急劇收縮，卵巢細(xì)胞大量凋亡，此為PMS發(fā)生的基礎(chǔ)。本研究在此基礎(chǔ)上探究平肝補(bǔ)腎藥方對(duì)PMS細(xì)胞模型凋亡和增殖水平的影響，結(jié)果證明平肝補(bǔ)腎藥方對(duì)PMS細(xì)胞模型的增殖和凋亡有調(diào)節(jié)作用。

ERK5是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子蛋白，其激活參與細(xì)胞的增殖與凋亡〔11,12〕。既往研究表明，ERK5參與機(jī)械牽張應(yīng)力作用下軟骨細(xì)胞的凋亡〔13〕，參與大鼠海馬組織在缺氧無(wú)糖環(huán)境刺激下的過度凋亡〔14〕?？梢姡魏渭?xì)胞外的化學(xué)信號(hào)，生物力學(xué)信號(hào)及缺氧信號(hào)等均可通過激活ERK5信號(hào)通路參與細(xì)胞凋亡和增殖。本研究說明平肝補(bǔ)腎藥方通過激活ERK5的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡。

Caspase家族參與細(xì)胞的凋亡，其中Caspase-3的激活往往啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，因此，Caspase-3也被稱作“死亡蛋白”〔15，16〕。而Caspase-6蛋白作為Caspase-3的啟動(dòng)因子也多見報(bào)道〔17〕。本研究說明平肝補(bǔ)腎藥方通過抑制Caspase-3和Caspase-6蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞的凋亡。

綜上，平肝補(bǔ)腎方通過激活ERK5信號(hào)通路，抑制Caspase-3和Caspase-6蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。