牛家慧 李創(chuàng) 李蓉 胡永權(quán) 張江畔 苑學(xué)微 樊靜珊 張亞宏

(石家莊市第二醫(yī)院口腔科，河北 石家莊 050051)

糖尿病(DM)和慢性牙周炎(CP)是世界范圍內(nèi)的兩種常見慢性疾病，近年來的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，兩者之間相互影響、相互促進(jìn)，DM是促進(jìn)CP發(fā)生和發(fā)展、誘發(fā)牙槽骨代謝異常和丟失的重要危險(xiǎn)因素之一〔1〕，DM人群患CP的風(fēng)險(xiǎn)和疾病程度要高于普通人群，而CP的治療情況也會(huì)對(duì)DM患者的血糖控制水平產(chǎn)生影響〔2〕。因此，提高針對(duì)DM合并CP的篩查診斷率和預(yù)防控制效果已成為口腔醫(yī)生面臨的新挑戰(zhàn)。一般來說，臨床上提倡針對(duì)DM合并CP患者進(jìn)行有效的全身和口腔管理，牙周基礎(chǔ)治療對(duì)于CP具有良好的預(yù)防和治療作用，研究證實(shí)針對(duì)2型糖尿病(T2DM)合并CP患者給予牙周基礎(chǔ)治療，對(duì)于緩解CP發(fā)展進(jìn)程和改善患者糖代謝狀態(tài)均可能具有積極的作用〔3，4〕，但缺乏針對(duì)牙周基礎(chǔ)治療前后齦下菌群變化的評(píng)價(jià)研究，特別是未見針對(duì)伴有骨質(zhì)代謝異常、器官功能障礙等基礎(chǔ)疾病的老年患者人群的專題性前瞻性研究，故本文采用高通量測序技術(shù)對(duì)老年T2DM合并CP患者牙周治療后齦下菌群的變化及對(duì)糖代謝的影響進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年6月至2020年8月石家莊市第二醫(yī)院口腔科住院治療的106例老年T2DM合并CP患者作為研究對(duì)象，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為研究組和對(duì)照組，每組各53例。兩組一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

所有患者對(duì)本研究知情并簽署知情同意書，本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)制訂的《中國2型糖尿病防治指南》中的T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)〔5〕，具體診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：①具有多尿、多飲及體重下降等DM癥狀，任意時(shí)間隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L和(或)空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L；②無DM癥狀但符合上述2項(xiàng)血糖異常診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)口服75 g葡萄糖后2 h血糖≥11.1 mmol/L。(2)CP診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)編制的《臨床診療指南·口腔醫(yī)學(xué)分冊》中的CP診斷標(biāo)準(zhǔn)〔6〕，患者牙齦變色、質(zhì)松軟、齦緣變厚、齦乳頭變圓鈍、牙齦組織表面光亮或點(diǎn)彩消失等臨床表現(xiàn)，可伴有牙齦肥厚、牙齒松動(dòng)和移位、牙髓病變、牙周膿腫、牙齦退縮、牙根面敏感等，可見牙齦紅腫或探診后有出血，探診深度>3 mm且附著喪失>1 mm，X線片檢查可見牙槽骨吸收。所有患者為輕度或中度牙周炎，其中輕度牙周炎診斷標(biāo)準(zhǔn)為：牙屬周袋深度<4 mm，X線片檢查顯示牙槽骨吸收≤根長的1/3。中度牙周炎診斷標(biāo)準(zhǔn)為：牙周袋深度≥4 mm且<6 mm，X線片檢查顯示牙槽骨吸收>根長的1/3且<根長的1/2。均經(jīng)專業(yè)口腔醫(yī)師檢查確認(rèn)非必須行牙周治療。臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并惡性腫瘤、肝腎功能不全、全身感染性疾病、免疫缺陷癥、血液系統(tǒng)疾病、終末期或急性DM并發(fā)癥的患者；(2)有牙周治療史及入組前2個(gè)月內(nèi)應(yīng)用抗菌藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、糖皮質(zhì)激素史的患者；(3)有牙周治療應(yīng)用禁忌者。

1.3治療方法 兩組患者入組后均給予牙周健康教育、飲食調(diào)節(jié)、戒煙戒酒等治療，指導(dǎo)患者采用正確的刷牙方法，多攝入蛋、蔬菜、低脂食品等有益于牙齒健康的食物，同時(shí)強(qiáng)化控制血糖，嚴(yán)格限制含糖食品的攝入，選用適合的口服降糖藥物和(或)胰島素治療，達(dá)到血糖控制目標(biāo)準(zhǔn)，即FPG 4.4～7.0 mmol/L，餐后2 h血糖(2 hPG)5.6～10.0 mmol/L。研究組在上述治療的基礎(chǔ)上給予牙周基礎(chǔ)治療，具體方法為采用超聲潔治器給予齦上潔治術(shù)，在清除菌斑、牙石后行根面平整術(shù)和齦下刮治術(shù)，術(shù)后每日3次以氯己定漱口。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1齦下菌群情況 于入組治療前及治療3個(gè)月時(shí)采集兩組齦下菌斑，采集方法為：在受檢對(duì)象口內(nèi)選擇磨牙探診深度≥4 mm且存在附著喪失的位點(diǎn)進(jìn)行采樣。去除齦上菌斑，棉卷隔濕所選患牙，吹干牙面，使用消毒的Gracey刮治器伸至牙周袋袋底，沿牙體長軸盡可能刮取全部齦下菌斑，所獲樣本立即轉(zhuǎn)入1.0 ml滅菌的3%硫乙醇酸鹽溶液，-20℃冷凍保存待用。立刻送微生物實(shí)驗(yàn)室。采用16S rRNA 基因高通量測序檢測法對(duì)齦下菌斑中菌群構(gòu)成進(jìn)行檢測，測序設(shè)備為Novaseq型第二代高通量測序儀(美國 Illumina 公司)，采用OSR-M502型TGuide 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取所得菌斑內(nèi)的基因組DNA，采用細(xì)菌16 s V2-V4區(qū)特異性引物作為引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，上游引物序列為5′-CGTGGACCAAAGATTCATCGGTGGA-3′，下游引物序列為5′-CCGCTT TACTCCCCA ACA AA-3′。反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件為：95℃ 3min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，72℃10 min。所得產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳得到對(duì)應(yīng)不同菌種的DNA條帶，采用Fluorchem2.0電泳凝膠成像分析軟件對(duì)電泳條帶的平均灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算細(xì)菌的相對(duì)含量。

1.4.2糖代謝和血脂指標(biāo) 于入組治療前及治療3個(gè)月時(shí)采集兩組空腹外周靜脈血樣本，采用Cobas e411型全自動(dòng)血液生化分析儀(瑞士羅氏公司)對(duì)FPG、糖化血紅蛋白(HbA1c)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)進(jìn)行檢測。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。

2 結(jié) 果

2.1兩組治療前、后齦下菌斑菌群相對(duì)含量 治療前，兩組齦下菌斑中各類病原菌相對(duì)含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療3個(gè)月時(shí)，兩組齦下菌斑中各類病原菌相對(duì)含量均較治療前明顯下降(P<0.05)，且研究組均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組治療前、后齦下菌斑菌群相對(duì)含量比較

2.2兩組治療前、后糖代謝和血脂指標(biāo) 治療前，兩組糖代謝和血脂指標(biāo)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療3個(gè)月時(shí)，兩組FPG、HbA1c、TG水平均較治療前明顯下降，且研究組均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者治療前、后糖代謝和血脂指標(biāo)的對(duì)比

3 討 論

老年T2DM合并CP患者普遍具有向心性肥胖、血糖控制不佳和脂質(zhì)代謝異常的特征〔7〕。DM和CP看似截然不同的兩種疾病，但兩者卻具有相同的遺傳背景、系統(tǒng)免疫應(yīng)答過激狀態(tài)及吸煙、高齡、冠心病、精神壓力、白細(xì)胞功能障礙等臨床危險(xiǎn)因素〔8〕。研究認(rèn)為，高血糖導(dǎo)致的高炎癥狀態(tài)、破骨活動(dòng)增強(qiáng)和骨修復(fù)減弱的骨代謝平衡失調(diào)、糖基化終末產(chǎn)物堆積及與其受體相互作用等均參與了CP的發(fā)生和發(fā)展〔9，10〕，特別是中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的趨化吞噬功能受損、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻、抗菌物質(zhì)和細(xì)胞因子過表達(dá)、凋亡延遲和細(xì)胞毒性物質(zhì)釋放等免疫炎癥機(jī)制在其中扮演著重要的角色〔11，12〕。相關(guān)研究顯示，DM合并CP患者的手指末梢血的血糖、HbA1c水平與齦溝血均具有高度的一致性，在CP患者人群中，DM的患病率超過了60%，口腔?？粕踔脸蔀楹Y查DM的重要場所，在糖尿病前期患者中，CP的病變程度與其糖耐量水平也具有相關(guān)性〔13，14〕。因此，口腔臨床醫(yī)生應(yīng)高度重視DM與CP的相關(guān)依賴關(guān)系，對(duì)于具有典型CP病變的老年患者，應(yīng)同時(shí)注意評(píng)價(jià)其糖代謝情況和DM患病風(fēng)險(xiǎn)。

本研究結(jié)果顯示，福賽斯坦納菌、牙齦卟啉單胞菌等厭氧菌是DM合并CP患者齦下菌斑中相對(duì)含量較高的病原菌，這與研究〔15〕結(jié)果基本一致。相關(guān)研究結(jié)果顯示，相對(duì)于健康人群和單純CP患者，T2DM合并CP患者唾液及齦下菌斑中的牙齦卟啉單胞菌、放線共生放線桿菌、放線共生放線桿菌的檢出率要明顯偏高，可疑致病菌的種類和數(shù)量均存在差異〔16，17〕，這可能與DM具有密切的相關(guān)性，中重度牙CP患者的牙齦卟啉單胞菌和中間型普雷沃菌檢出率均高于輕度患者，而HbA1c較高的中重度CP患者的福賽斯坦納菌檢出率及相對(duì)含量也較高。同時(shí)，T2DM合并CP患者齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌的菌毛蛋白A基因型也與單純CP患者具有明顯的差異，此類患者更易感染毒力較強(qiáng)的菌毛蛋白AⅡ型牙齦卟啉單胞菌〔18〕，這都說明了DM患者糖代謝異常的加劇，其全身微環(huán)境的改變可對(duì)牙周局部菌斑微生物的定植種類及毒力產(chǎn)生影響。本研究采用了高通量測序技術(shù)作為檢測技術(shù)，高通量測序技術(shù)被稱為二代測序技術(shù)，采用了基于焦磷酸測序的并行測序技術(shù)，能夠以更低的檢測成本獲得更高通量的數(shù)據(jù)并實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的基因組研究，在單次運(yùn)行中可同時(shí)對(duì)多達(dá)數(shù)百萬個(gè)DNA分子進(jìn)行測序，是DNA測序技術(shù)發(fā)展中里程碑式的突破，已被應(yīng)用于眾多的腫瘤診斷、靶向治療等多個(gè)臨床領(lǐng)域〔19〕，在微生物檢測領(lǐng)域，高通量測序技術(shù)也在病原菌鑒定、耐藥機(jī)制研究、藥物新靶點(diǎn)分析、耐藥菌流行病學(xué)、抗感染用藥指導(dǎo)等方面體現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢，應(yīng)用越來越廣泛，成為病原微生物研究領(lǐng)域中一項(xiàng)新的研究技術(shù)和方法〔20〕。本研究采用高通量測序技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)患者齦下菌斑中病原菌相對(duì)含量的快速、準(zhǔn)確檢測，取得了較好的應(yīng)用效果。

研究顯示，牙周基礎(chǔ)治療能夠顯著改善牙周支持組織狀態(tài)、降低齦溝局部的炎癥因子表達(dá)、減少高毒力病原菌定植、下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞免疫炎癥基因〔21〕，但針對(duì)輕中度CP的周牙基礎(chǔ)治療是否必要方案仍然是一項(xiàng)具有爭議的課題。研究者發(fā)現(xiàn)牙周基礎(chǔ)治療可有效提升口腔的清潔度并改善牙周狀況，另一方面，牙周基礎(chǔ)治療還能夠減輕T2DM患者的胰島素拮抗程度，提升胰島素敏感脂肪因子的表達(dá)水平，有利于改善患者的糖脂代謝異常〔22，23〕。本研究提示牙周基礎(chǔ)治療對(duì)于改善患者口腔微生物環(huán)境和糖代謝狀態(tài)具有積極的意義。分析其原因，牙周基礎(chǔ)治療可能通過對(duì)牙周病原菌的清除下調(diào)患者口腔局部及全身的炎癥反應(yīng)程度，從而緩解對(duì)牙周組織和代謝器官的炎癥損害，進(jìn)而發(fā)揮治療作用〔24，25〕。

綜上，針對(duì)合并輕中度CP的老年T2DM患者給予牙周基礎(chǔ)治療，能夠有效減少其齦下菌斑中的厭氧致病菌含量，改善患者的糖代謝及脂質(zhì)代謝指標(biāo)，具有較好的輔助治療效果。