高會(huì)彬，鄭仁紅，周國(guó)強(qiáng)，楊海蕓，余 英

（1.宜賓林竹產(chǎn)業(yè)研究院，四川 宜賓644000；2.浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江杭州311300）

花葉矢竹（Pseudosasa japonicaf.Akebonosuji）是矢竹（Pseudosasa japonica）的變型，稈型挺拔、葉片長(zhǎng)披針形，葉片呈現(xiàn)白色、白綠相間條條紋、綠色等多種混合顏色，其條紋寬窄、長(zhǎng)短、在葉片上的位置各不相同，這是竹子在自然界中稈色、葉色變異的典型特性，正是這種變異豐富了竹子的種類，也提高了觀賞價(jià)值［1］?；ㄈ~矢竹作為一個(gè)代表性竹種，其獨(dú)特在于其白葉在自然條件下能夠逐漸恢復(fù)綠色，在組培條件下卻保持花葉狀態(tài)，這為竹子稈色葉色變異機(jī)理的研究提供了寶貴材料［2］。

竹子作為觀賞植物，近年來(lái)，花葉、花稈、特型竹等受到越來(lái)越多的關(guān)注，在園林綠化中的應(yīng)用也在逐年增加，花葉矢竹組培生根壯苗后可以為園林綠化、盆景創(chuàng)作等提供大量的種苗。叢生芽的生根誘導(dǎo)是竹類植物試管快繁成功的關(guān)鍵［1］，叢生型竹類組織培養(yǎng)技術(shù)研究種多利用叢生芽的誘導(dǎo)方式［3－7］，也有部分叢生竹和散生竹利用種子繁殖［8－10］，菲白竹等混生竹也利用叢生芽誘導(dǎo)方式［11－12］，研究發(fā)現(xiàn)外植體為莖段的花葉矢竹無(wú)菌苗能夠自然生根［2］，但是愈傷組織分化苗卻不能直接生根，生根能力等并不清楚，因此，以愈傷組織分化苗為外植體，建立完善的組織培養(yǎng)技術(shù)體系，明確組培生根壯苗的條件，對(duì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)基因和研究試管苗與傳統(tǒng)繁殖竹苗葉色變化的差異有重要的意義。本文主要研究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)花葉矢竹根的萌發(fā)、生長(zhǎng)周期和生根效率的影響，優(yōu)化篩選最佳生根壯苗的培養(yǎng)基，為花葉矢竹等觀賞竹類在葉色變異的研究和園林綠化、美化環(huán)境等方面提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1．1 材料培養(yǎng)

取材愈傷組織分化的花葉矢竹無(wú)菌苗，來(lái)自宜賓市林竹產(chǎn)業(yè)研究院組培室。實(shí)驗(yàn)前生長(zhǎng)在無(wú)任何添加的MS基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室溫度（25±2）℃，每天光照周期16 h／8 h。

1．2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取材 選擇生長(zhǎng)一致的花葉矢竹無(wú)菌苗，選取3－5個(gè)芽為一叢，剝?nèi)ダ先~等留取干凈幼嫩的新芽作為試驗(yàn)材料。

1.2.2 生根壯苗單因素試驗(yàn) 以MS為基本培養(yǎng)基，研究不同濃度植物生長(zhǎng)素NAA、IBA對(duì)生根壯苗的影響。各設(shè)5個(gè)濃度梯度，NAA濃度設(shè)置為0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mg·L－1；IBA的濃度設(shè)置為：0.2、0.5、1、3、5 mg·L－1；培養(yǎng)基中蔗糖30 g·L－1，gelrite 2.5 g·L－1，pH 5.8。每個(gè)處理接種20叢（20管，1叢／管），每隔2 d觀察一次，培養(yǎng)4周后記錄生根并觀察記錄生長(zhǎng)情況。

1.2.3 生根壯苗正交試驗(yàn) 采用L9（33）正交設(shè)計(jì)（因素水平參見表1），探究植物激素交互對(duì)根誘導(dǎo)、壯苗的影響?；九囵B(yǎng)基：MS，分別添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合（表1），蔗糖30 g·L－1，gelrite 2.5 g·L－1，pH 5.8。每瓶接種1叢，每個(gè)處理20叢。培養(yǎng)4周后統(tǒng)計(jì)生根及增殖系數(shù)，觀察記錄生長(zhǎng)情況。

表1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)及濃度正交設(shè)計(jì)方案Tab.1 Orthogonal design scheme of various plant growth regulatory substances and concentrations

1.2.4 培養(yǎng)條件 光培養(yǎng)條件：溫度（23±2）℃，光照2 600 LUX左右，16 h·d－1。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 無(wú)菌苗生根培養(yǎng)接種后，每2 d觀察根的萌動(dòng)、芽生長(zhǎng)、葉片顏色的變化，在4周的時(shí)候記錄生根數(shù)，測(cè)量根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、芽苗生長(zhǎng)狀況、褐化程度等，相關(guān)數(shù)據(jù)計(jì)算公式如下：

生根率＝生根管數(shù)／接種總管數(shù)×100%；平均根長(zhǎng)＝每管平均根長(zhǎng)／生根總管數(shù)；芽增殖系數(shù)＝每管芽數(shù)之和／接種總管數(shù)；平均新生芽長(zhǎng)＝每管平均芽長(zhǎng)之和／抽芽總管數(shù)；褐化評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：0度：完全無(wú)褐色，基部呈綠色；1度：基部有輕微褐化，基部根綠色部分可見，紋理可見；2度：基部完全褐化，無(wú)綠色部分，紋理不可見；3度：基部完全褐化，培養(yǎng)基上面有枯葉現(xiàn)象；4度：基部完全褐化，培養(yǎng)基上面植株枯萎；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用EXCEl統(tǒng)計(jì)后通過SPSS 22.0軟件對(duì)進(jìn)行方差分析，用ORIGIN軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同濃度NAA對(duì)生根壯苗的影響

2.1.1 不同濃度NAA對(duì)生根誘導(dǎo)的影響 如表2所示，不同濃度NAA顯著影響不定根生根數(shù)和生根長(zhǎng)度。NAA 5個(gè)濃度處理不定根，培養(yǎng)30 d后，結(jié)果經(jīng)過對(duì)比后表明，添加NAA花葉矢竹生根率均能達(dá)到80%及以上。濃度增加對(duì)不定根的誘導(dǎo)產(chǎn)生積極影響，生根率、平均根數(shù)隨濃度增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在濃度為0.5、1.0 mg·L－1時(shí)生根率最大，為100%，根白色、細(xì)長(zhǎng)，隨濃度繼續(xù)增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。濃度過低不利于不定根的誘導(dǎo)，平均根數(shù)較少，濃度過高對(duì)生根數(shù)量有抑制作用。當(dāng)NAA濃度為1.0 mg·L－1時(shí)，平均根數(shù)最大，為8.1。生根長(zhǎng)度為低濃度誘導(dǎo)效果明顯。低濃度（0.2、0.5 mg·L－1）處理的根長(zhǎng)約是高濃度根長(zhǎng)的2倍，濃度為1.0、2.0、4.0 mg·L－1時(shí)根長(zhǎng)相近。

表2 不同濃度的NAA對(duì)花葉矢竹試管苗生根誘導(dǎo)的影響Tab.2 Effects of different concentrations of NAA on rooting induction of Pseudosasa japonica f.akebonosuji plantlets

2.1.2 不同濃度NAA對(duì)壯苗的影響 不同濃度NAA對(duì)花葉矢竹增殖系數(shù)有顯著影響。0.2 mg·L－1時(shí)達(dá)到最大，為8.5（表3）。低濃度（0.2、0.5、1.0 mg·L－1）新芽長(zhǎng)勢(shì)較好，明顯優(yōu)于高濃度（2.0、4.0 mg·L－1）。濃度0.5 mg·L－1植株長(zhǎng)勢(shì)最佳，總體芽抽長(zhǎng)約為原芽長(zhǎng)2倍。從增殖系數(shù)、平均新芽長(zhǎng)以及長(zhǎng)勢(shì)看，NAA濃度0.2 mg·L－1時(shí)，壯苗效果最好。

表3 不同濃度NAA對(duì)壯苗的影響Tab.3 Effects of different concentrations of NAA on seedling strengthening

2．2 不同濃度IBA對(duì)生根壯苗的影響

結(jié)果顯示（表4），IBA對(duì)花葉矢竹生根數(shù)、根長(zhǎng)、新芽數(shù)、新芽長(zhǎng)影響顯著。但生根率普遍偏低，生根效果不好。隨著IBA濃度的增加，生根率、平均生根數(shù)量都有所增加，生根率最高可達(dá)70%，平均根數(shù)在濃度為3.0 mg·L－1達(dá)到最大，達(dá)3.15。但是高質(zhì)量濃度的IBA培養(yǎng)基中花葉矢竹的根部較膨大，為畸形根系。

圖1 不同濃度NAA花葉矢竹芽苗生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of shoots of Pseudosasa japonica f.akebonosuji at different concentrations of NAA

表4 不同濃度IBA對(duì)生根及長(zhǎng)勢(shì)的影響Tab.4 Effects of different concentrations of IBA on rooting and growth

圖2 不同濃度IBA花葉矢竹長(zhǎng)勢(shì)、生根情況Fig.2 Growth and rooting conditions of Pseudosasa japonica f.akebonosuji with different concentrations of IBA

IBA濃度0.2 mg·L－1時(shí)，增殖系數(shù)最大，達(dá)12.5，芽苗綠色，長(zhǎng)勢(shì)好。濃度0.2、0.5、1.0、3.0 mg·L－1時(shí)，葉片黃綠色，芽翠綠色，芽抽長(zhǎng)，增殖系數(shù)較大。在IBA濃度為5.0 mg·L－1時(shí)，芽無(wú)抽長(zhǎng)，增殖系數(shù)小植株枯黃長(zhǎng)勢(shì)差。

2．3 不同濃度IBA對(duì)生根周期的影響

由圖3、圖4可知，NAA、IBA濃度對(duì)生根周期有影響。不定根萌動(dòng)周期隨著NAA濃度的增加，呈現(xiàn)先縮短后增長(zhǎng)的趨勢(shì)，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，萌發(fā)率增長(zhǎng)趨勢(shì)減緩。NAA濃度0.5 mg·L－1時(shí)周期最短，生根率15 d達(dá)80%。而濃度過低或者過高時(shí)，不定根的萌動(dòng)周期較長(zhǎng)，需要30 d，生根率達(dá)80%以上。由圖表可以看出，濃度0.5、1.0、2.0 mg·L－1生根率均能達(dá)到100%，但周期隨濃度增加逐漸變長(zhǎng)，濃度1.0、2.0 mg·L－1的周期一致，在4.0 mg·L－1時(shí)萌動(dòng)周期最長(zhǎng)，15 d時(shí)沒有萌動(dòng)跡象，在30 d左右時(shí)生根率達(dá)到85%。生根率在30 d后隨著時(shí)間增加變化不大。

圖3 NAA不同濃度、不同周期間生根率Fig.3 Rooting rate at different NAA concentrations for various duration

圖4 不同濃度IBA、不同生長(zhǎng)周期下生根率Fig.4 Rooting rate at different IBA concentrations for various duration

添加IBA培養(yǎng)15 d，濃度對(duì)生根率影響不成規(guī)律。培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，生根率隨著IBA濃度的增加，呈上升趨勢(shì)，到3.0 mg·L－1時(shí)達(dá)到最大后，濃度再升高趨勢(shì)減緩。說明IBA誘導(dǎo)生根周期較長(zhǎng)。濃度低于1.0 mg·L－1時(shí)生根率低，高于1.0 mg·L－1時(shí)，生根率最高可達(dá)75%。

2．4 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對(duì)生根壯苗的影響

如表5、6，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)花葉矢竹生根實(shí)驗(yàn)中，NAA對(duì)新芽長(zhǎng)有顯著影響，對(duì)新芽數(shù)沒有顯著影響；而IBA、6-BA對(duì)芽長(zhǎng)、新芽數(shù)都沒有顯著影響。

表5 不同濃度IBA對(duì)芽長(zhǎng)方差分析Tab.5 ANOVA of different concentrations of IBA on bud length

表6 不同濃度IBA對(duì)新芽數(shù)方差分析Tab.6 ANOVA of different concentrations of IBA on new bud number

結(jié)果表明（表7），生根率以編號(hào)2處理效果最佳，達(dá)70%，平均根長(zhǎng)0.4 cm，小于單因素NNA 2號(hào)處理0.955 cm。3－9號(hào)處理培養(yǎng)基褐化嚴(yán)重，從培養(yǎng)基、芽苗基部褐化程度可以看出，隨著6-BA濃度增加培養(yǎng)基、基部褐化程度逐漸加重。在新芽長(zhǎng)度指標(biāo)上僅NAA具有顯著性差異，在新芽數(shù)指標(biāo)上，NAA、IBA、BA均無(wú)顯著性差異。當(dāng)NAA濃度增加，新芽長(zhǎng)呈遞減趨勢(shì)，與單因素NNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

表7 正交實(shí)驗(yàn)中不同種類與濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)生根壯苗及長(zhǎng)勢(shì)的影響Tab.7 Effects of different types and concentrations of plant growth regulatory substances on rooting and seedling growth in the orthogonal experiment

圖5 正交實(shí)驗(yàn)9個(gè)處理生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth under orthogonal experiments of 9 treatments

9種植物激素組合處理對(duì)花葉矢竹生根有一定的影響，但生根率、增值系數(shù)都較單獨(dú)添加NAA、IBA時(shí)低，長(zhǎng)勢(shì)上葉片發(fā)黃、枯萎。總體來(lái)看，9種處理對(duì)生根誘導(dǎo)沒有積極影響，試驗(yàn)所設(shè)計(jì)激素濃度組合生根壯苗效果均不及單獨(dú)添加NAA或IBA。

2．5 活性炭對(duì)花葉矢竹生根壯苗的影響

MS＋NAA 0.5 mg·L－1培養(yǎng)基添加不同濃度活性炭，結(jié)果表明：添加活性炭會(huì)抑制生根，單獨(dú)添加NAA生根率可達(dá)100%，而增加活性炭培養(yǎng)4周后，花葉矢竹不生根，新增芽數(shù)及芽長(zhǎng)都較不添加活性炭時(shí)低。

表8 不同活性炭濃度對(duì)生根壯苗的影響Tab.8 Effects of different activated carbon concentrations on rooting and seedling strengthening

2．6 不同濃度糖對(duì)花葉矢竹生根壯苗的影響

糖對(duì)花葉矢竹生根壯苗影響不顯著。在MS＋NAA 0.5 mg·L－1的培養(yǎng)基中添加不同濃度的糖，其增殖系數(shù)、芽長(zhǎng)、根數(shù)、根長(zhǎng)、生根率有差異。根據(jù)長(zhǎng)勢(shì)觀察添加糖的含量在30 g·L－1時(shí)芽苗較粗壯，長(zhǎng)勢(shì)較好。

2．7 不同濃度激素單獨(dú)添加對(duì)生根壯苗的影響

BA、TDZ均對(duì)芽增殖、芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)影響不顯著，對(duì)生根數(shù)量有顯著性影響。隨著濃度的升高，根數(shù)成上升趨勢(shì)，在濃度為0.05 mg·L－1時(shí)，平均生根數(shù)量達(dá)到最高，0.9根。生根率沒有呈現(xiàn)規(guī)律，在濃度0.01 mg·L－1時(shí)，達(dá)90%。TDZ在濃度0.005 mg·L－1平均根數(shù)達(dá)到0.3根，隨著濃度的繼續(xù)增加，平均根數(shù)保持在0.3根。生根率隨著TDZ濃度的增加呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。

表9 不同濃度糖對(duì)生根壯苗的影響Tab.9 Effects of different concentrations of sugar on rooting s rooting and seedling strengthening

表10 不同濃度激素單獨(dú)添加對(duì)生根壯苗的影響Tab.10 Effects of different concentrations of hormones on rooting and seedling strengthening

2．8 不同濃度組合植物激素對(duì)花葉矢竹壯苗的影響

組合添加6-BA＋ZT對(duì)芽增殖、芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)影響不顯著，對(duì)平均根數(shù)有顯著性影響。平均根長(zhǎng)、生根率都隨著組合激素中6-BA濃度的增加而上升，在6-BA濃度0.05 mg·L－1＋ZT 0.5 mg·L－1時(shí)，數(shù)值達(dá)到最大，平均根長(zhǎng)0.25 cm、生根率50%。

表11 不同濃度組合植物激素對(duì)壯苗的影響Tab.11 Effects of different concentration combinations of plant hormones on seedling strengthing

3 結(jié)論與討論

3．1 NAA促進(jìn)花葉矢竹生根，IBA對(duì)壯苗有促進(jìn)作用

植物不定根原基發(fā)生和發(fā)育依賴于多種因子，尤其是低溫和生長(zhǎng)素起關(guān)鍵作用［13］。NAA、IBA是竹類植物生根培養(yǎng)常用激素，添加外源生長(zhǎng)素，刺激植物體內(nèi)激素平衡轉(zhuǎn)向根萌發(fā)的方向［14－15］。本研究中，NAA對(duì)花葉矢竹生根影響顯著，濃度0.5 mg·L－1時(shí)，根誘導(dǎo)周期最短，培養(yǎng)30 d，生根率達(dá)到100%；培養(yǎng)50 d后，根長(zhǎng)均達(dá)到練苗要求，濃度過高或過低都不利于根的誘導(dǎo)，持續(xù)觀察中，單獨(dú)添加NAA花葉矢竹芽苗以及基部可以維持90 d不褐化；添加IBA培養(yǎng)30 d，生根率最高只有70%，根長(zhǎng)較長(zhǎng)，根數(shù)較少?；亢只瘒?yán)重。隨著IBA濃度增加，根有加粗現(xiàn)象，但生長(zhǎng)趨勢(shì)表現(xiàn)逐漸衰退，濃度5.0 mg·L－1時(shí)根部膨大畸形，但是從壯苗角度考慮，添加低濃度（0.2、0.5 mg·L－1）IBA利于花葉矢竹芽苗生長(zhǎng)。

在NAA生根培養(yǎng)基中添加活性炭、6-BA、TDZ對(duì)花葉矢竹生根壯苗均有抑制作用。糖添加30 g·L－1時(shí)芽苗生長(zhǎng)狀態(tài)最好，芽較粗壯。這與高明遠(yuǎn)研究中可溶性糖提高可降低滲透勢(shì)，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，利于光合作用有關(guān)［16］。

3．2 不同發(fā)生途徑的芽苗生根能力不同

有研究表明，適當(dāng)添加低濃度的BA有利于竹子無(wú)菌苗芽苗的生長(zhǎng)與生根［17］，但本研究中，IBA 1.0 mg·L－1＋6-BA 0.3 mg·L－1＋NAA 1.0 mg·L－1，生根率最高70%，長(zhǎng)勢(shì)好，而其他處理生根效果并不理想，生根率低、芽苗生長(zhǎng)長(zhǎng)勢(shì)差，基部褐化嚴(yán)重，這可能與無(wú)菌芽苗來(lái)源于愈傷組織分化苗、以及基因型有關(guān)，竹子本身萌蘗和生根能力都比較強(qiáng)，并不需要過多的外源激素刺激和誘導(dǎo)，過多會(huì)對(duì)芽苗生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制。在本課題組前期莖段側(cè)芽無(wú)菌萌發(fā)研究中，當(dāng)生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素組合誘導(dǎo)增殖生長(zhǎng)后，轉(zhuǎn)移到無(wú)激素添加的MS培養(yǎng)基中會(huì)直接生根［2］，根的形態(tài)與芽苗形態(tài)相關(guān)，芽苗粗壯時(shí)根數(shù)較為粗壯、纖維化程度高，而愈傷組織分化的芽苗幼嫩程度高，根多而細(xì)。

3．3 問題與展望

在接種10 d內(nèi)，發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的芽苗黃葉枯萎現(xiàn)象，除了受到植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)影響外，也可能是由于首次使用封口膜對(duì)試管進(jìn)行封口，膜透氣孔徑過大，導(dǎo)致試管內(nèi)水分蒸發(fā)過快，芽苗失水。

竹子組培苗隨著繼代次數(shù)的增多，會(huì)出現(xiàn)叢芽增殖率下降、長(zhǎng)勢(shì)變差等現(xiàn)象［18］?；ㄈ~矢竹在生根壯苗過程中，芽苗的長(zhǎng)勢(shì)變差，這可能與試驗(yàn)材料是采用的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)多次繼代的無(wú)菌無(wú)菌苗有關(guān)。