王秋宇 姜 平 朱軍義 許 靜 李和麗 郭 哲

（南陽市中心醫(yī)院婦科，南陽 473000）

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生在子宮內(nèi)膜上的疾病，發(fā)病人群趨于年輕化[1]。目前，對子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的危險因素及其生物學(xué)行為尚不明確。隨著子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展，癌細胞浸潤程度的增加，生存率不斷降低，闡明其發(fā)病機制對子宮內(nèi)膜癌防治具有重要作用[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是由18～24個核苷酸組成的非編碼RNA，對多種基因具有調(diào)節(jié)作用，能夠進行DNA調(diào)節(jié)，誘發(fā)mRNA降解，調(diào)節(jié)細胞生物活性。以往研究文獻表明，miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。miR-143屬于其中之一，已經(jīng)證實其在宮頸癌及腎癌中具有抑制癌細胞活性的作用[3]。解整合素金屬蛋白酶17 （disintegrin and metalloproteinase domaincontaining protein 17，ADAM17）生物活性廣泛，具有解聚素和金屬蛋白酶的作用。眾多學(xué)者認為在多種惡性腫瘤中ADAM17陽性率顯著高于癌旁組織[4]。目前，關(guān)于miR-143對子宮內(nèi)膜癌及ADAM17作用的研究較少。本研究通過體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌細胞并轉(zhuǎn)染miR-143，觀察其生物活性和對ADAM17水平的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞來源和主要試劑

人子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞中心。miR-143 mimics，miR-143-NC（上海生工）；兔抗人ADAM17多克隆抗體（北京來福賽思科技生物）；MTT、DMSO（上海研謹生物科技）。

1.2 HEC1B細胞培養(yǎng)及分組

將低溫冷藏的HEC1B細胞株，快速移入37℃水中溶解，離心后，離棄上清液，加入培養(yǎng)基，每隔1 d更換培養(yǎng)液，生長到85%～90%時，消化傳代，取對數(shù)生長細胞分為內(nèi)膜癌組、NC組、miR-143 mimics干預(yù)組，內(nèi)膜癌組為HEC1B細胞株，NC組為HEC1B細胞株轉(zhuǎn)染miR-143-NC，干預(yù)組為HEC1B細胞株轉(zhuǎn)染miR-143 mimics。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

將數(shù)量為1×104個的HEC1B細胞株接種到96孔中，15 h后，待HEC1B細胞重復(fù)融合，在EP管中放入200 μL轉(zhuǎn)染液體和4 μL脂質(zhì)體，后加入5 μg的miR-143 mimics、miR-143-NC，充分混合后，轉(zhuǎn)染9 h后，用含血清、雙抗的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR檢測細胞miR-143表達水平

取105/mL HEC1B細胞懸液，采用0.25%胰蛋白酶消化，采用TRIzol法提取總RNA，無核酸酶溶解。將提取的RNA進行轉(zhuǎn)錄為cDNA，獲得反體系，條件為：42℃作用60 min，72℃作用5 min，4℃終點。每個細胞設(shè)置6個復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參，反應(yīng)條件為95℃預(yù)作用3 min，95℃作用5 s，58℃退火，40個循環(huán)，miR-143內(nèi)參上游序列為5'- TGAGATGAACCACTGTAGGTC-3'，下游序列為5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'；內(nèi)參GAPDH上游序列為5'-CCATGCAGAAGG CTGGGG-3'，下游序列為5'-CAAAGTTGTCATGG ATGACC-3'，用相對定量2-ΔΔCT計算miR-143表達。

1.5 MTT法檢測細胞株活性抑制率

取0.6×104個/mL HEC1B細胞接種在96孔板中，消化后，加入1%的血清繼續(xù)培養(yǎng)，將3組細胞置于5%CO2的飽和濕度箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)0、24、48、72 h及96 h后加入MTT（5 g/L），每孔20 μL。4 h后離棄上清液，加入200 μL的DMSO，在490 nm檢測吸光度（OD值），取3次平均值。

1.6 流式細胞儀檢測各組HEC1B細胞凋亡

取2×105個/mL HEC1B細胞懸液，PBS溶液予以洗滌，離心5 min，運用100 μL 結(jié)合緩沖液，對細胞進行重懸，用 5 μL 標記FITC的AnnexinⅤ與5 μL PI 染色混勻，無光條件下，孵育15 min后注入400 μL 結(jié)合緩沖液混勻，予以洗滌，次數(shù)3次，記錄細胞凋亡情況。

1.7 Transwell小室檢測細胞侵襲能力

取1.5×104個/mL HEC1B細胞懸液，將50 mg/L的基質(zhì)膠稀釋后加入小室上層，37℃下呈凝膠狀態(tài)，細胞數(shù)目為1×105/mL，上室中加入細胞懸液，下室中加入少量胎牛血清培養(yǎng)基，37.5℃，培養(yǎng)48 h，取出培養(yǎng)基，拭去殘留細胞，0.1%結(jié)晶紫染色，計算HEC1B細胞侵襲細胞數(shù)。

1.8 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

1 mL細胞懸液接種于6孔板，加無血清DMEM培養(yǎng)6 h，單層生長。用10 μL Eppendorf Tip在細胞板上劃痕，無血清培養(yǎng)液洗3次，加新鮮的無血清培養(yǎng)基。用Image-Pro Plus 6.0軟件測量劃痕距離。

1.9 免疫印跡檢測細胞兔抗人ADAMl7蛋白水平

1 mL的HEC1B細胞懸液，加入胰蛋白裂解液，4 000 r/min離心后，將上清液放入EP管中。在血清樣品中加入樣孔。進行電泳，PVDF膜TBS浸泡10 min，反復(fù)PBS沖洗，每次5 min，分別加入兔抗人ADAM17，GAPDH抗體（1∶500）、過氧化物酶標記二抗（1∶2 000），PBS沖洗。后將膜浸入ECL工作液，隨后進行檢測，獲取圖像。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，HEC1B細胞OD值、凋亡侵襲、遷移及ADAM17蛋白水平以±s表示，組間比較用t檢驗，多組間比較采用方差分析，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞中miR-143相對表達量

內(nèi)膜癌組、NC組及干預(yù)組HEC1B細胞的miR-143相對表達量分別為1.00±0.00，1.02±0.03及1.63±0.12；干預(yù)組HEC1B細胞的miR-143相對表達顯著高于內(nèi)膜癌組、NC組（均P<0.05），說明轉(zhuǎn)染成功。

2.2 過表達miR-143對各組細胞活性的影響

內(nèi)膜癌組及NC組HEC1B細胞活性O(shè)D值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；處理48、72、96 h時，干預(yù)組分別與內(nèi)膜癌組及NC組相比，HEC1B細胞活性O(shè)D降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），顯示過表達miR-143能夠抑制HEC1B細胞活性（表1）。

表1 各組HEC1B細胞活性O(shè)D值比較（±s）

表1 各組HEC1B細胞活性O(shè)D值比較（±s）

*P<0.05 vs內(nèi)膜癌組；#P<0.05 vs NC組

組別 0 h 24 h 48 h 72 h 96 h內(nèi)膜癌組 0.250±0.060 0.351±0.070 0.600±0.060 1.030±0.100 1.790±0.150 NC組 0.247±0.080 0.347±0.090 0.559±0.070 0.998±0.090 1.700±0.130干預(yù)組 0.252±0.076 0.348±0.082 0.404±0.070*# 0.607±0.100*# 1.020±0.110*#P值 0.998 0.997 <0.001 <0.001 <0.001

2.3 過表達miR-143對各組細胞凋亡率的影響

內(nèi)膜癌組及NC組HEC1B細胞凋亡率分別為4.55%±0.38%及5.00%±0.51%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；干預(yù)組HEC1B細胞凋亡率為29.89%±1.60%，較內(nèi)膜癌組及NC組顯著增加，（P<0.05）（圖1）。

圖1 各組HEC1B凋亡率比較。

2.4 過表達miR-143對各組細胞侵襲數(shù)目的影響

內(nèi)膜癌組及NC組HEC1B細胞侵襲數(shù)目分別為（230.45±17.20） 個及（227.90±20.15） 個，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；干預(yù)組HEC1B細胞侵襲數(shù)目為（75.95±10.55） 個，與內(nèi)膜癌組及NC組相比侵襲數(shù)目降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。

圖2 各組HEC1B細胞侵襲數(shù)目比較。

2.5 過表達miR-143對各組細胞遷移距離的影響

內(nèi)膜癌組及NC組HEC1B細胞遷移距離分別為 （265±75） μm和 （260±80） μm，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；干預(yù)組HEC1B細胞遷移距離為（152±43）μm，與內(nèi)膜癌組及NC組相比遷移距離減小，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖3）。

圖3 各組HEC1B細胞遷移數(shù)目比較。

2.6 過表達miR-143對各組細胞ADAMl7蛋白水平的影響

內(nèi)膜癌組及NC組HEC1B細胞ADAMl7蛋白相對水平分別1.00±0.00及0.95±0.03，比較無差異（P>0.05）；干預(yù)組ADAMl7蛋白相對水平0.45±0.06，與內(nèi)膜癌組及NC組相比HEC1B細胞中ADAMl7蛋白表達降低，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖4）。

圖4 各組HEC1B細胞ADAM17蛋白相對表達

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性惡性腫瘤中的常見疾病，根據(jù)最新數(shù)據(jù)顯示，每年有20萬新增患者，是導(dǎo)致女性患者死亡的主要原因。目前，早期患者治療預(yù)后較好，但中晚期患者生存率較低，了解其生物活性機制及尋找有效治療方案用于改善生存率及預(yù)后具有重要作用[5-6]。近些年，隨著分子領(lǐng)域研究的不斷深入，miRNA從最初的表達譜的差異分析到現(xiàn)在對生物功能的研究均發(fā)揮了顯著作用。miRNA在全基因組中呈現(xiàn)低表達，但是研究表示在惡性腫瘤中具有非隨機性，具有改變疾病狀態(tài)下的RNA形式，介導(dǎo)其水平升高或降低，改善調(diào)控系統(tǒng)紊亂現(xiàn)象[7]。miR-143已經(jīng)被證實能夠抑制結(jié)腸癌、胃癌及胰腺癌中細胞生物活性，但是在子宮內(nèi)膜癌女中研究還相對有限，因此，本研究建立上述實驗研究，分析其研究機制。

子宮內(nèi)膜癌是在多環(huán)境、多致癌因素的作用誘導(dǎo)機體免疫功能障礙時，細胞生長失調(diào)，導(dǎo)致異常增生，加快癌細胞產(chǎn)生。HEC1B細胞侵襲能力較強，能夠通過減少細胞凋亡，誘導(dǎo)DNA快速復(fù)制，加大癌細胞有絲分裂，加快新病灶形成及向旁癌組織擴散[8]。研究表示，子宮內(nèi)膜癌疾病發(fā)展具有時間依賴性，能夠通過不同增生方式產(chǎn)生浸潤性癌，加快術(shù)后患者殘留癌細胞的轉(zhuǎn)移及侵襲，惡化病情[9]。癌屬于一種基因病變，子宮內(nèi)膜癌產(chǎn)生機制與癌基因、抑癌基因及DNA修復(fù)損傷相關(guān)。miRNA與多種腫瘤形成及發(fā)展具有相關(guān)性。研究表示，有超過50%的miRNA在癌癥相關(guān)基因組附近。miRNA具有雙重作用，既可以是抑癌基因，也可以是致癌基因[10]。miR-143起初在直腸癌細胞中被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過多項研究證實，多種惡性腫瘤均存在miR-143異常表達，在卵巢癌及乳腺癌中表達降低，主要通過其靶基因來發(fā)揮功能。miR-143在胚胎組織水平顯著升高，具有保護子宮組織的作用。當在子宮內(nèi)膜癌中表達降低時，往往意味著抑癌基因作用失效。王穎等[11]研究顯示，隨著子宮內(nèi)膜癌病情的發(fā)展，伴隨淋巴轉(zhuǎn)移及腫瘤分級越高，miR-143表達水平越低。Chang等[12]研究表明，過表達miR-143能夠降低乳腺癌及宮頸癌細胞活性，加快凋亡。本研究結(jié)果顯示，過表達miR-143能夠降低HEC1B細胞活性，減少侵襲及遷移數(shù)目，加快凋亡，說明miR-143能夠降低HEC1B細胞生物活性，這與Zhang等[13]的研究結(jié)果相似。

ADAM17屬于為腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)換酶，能夠水解多種TGF-α、HB-EGF等因子，ADAM17在乳腺癌、前列腺癌等疾病中顯著高于癌旁組織，已經(jīng)證明，ADAM17能夠參與癌細胞發(fā)生及發(fā)展[14-15]。ADAM17生物活性較廣泛，能夠釋放多種結(jié)構(gòu)差異的活性物質(zhì)，進而調(diào)節(jié)細胞生物活性。柳新等[16]研究顯示，子宮內(nèi)膜增生患者ADAM17的陽性低于子宮內(nèi)膜癌患者，表示ADAM17升高，說明子宮內(nèi)膜癌患者疾病加重，并能夠作為判斷疾病輕重的有效指標。歐奇志等[17]研究表明，ADAM17能夠加快腫瘤細胞生長及侵襲是通過增加EGFR配體功能而發(fā)揮作用的。目前，關(guān)于子宮內(nèi)膜癌中miRNA所調(diào)控的相關(guān)信號及靶基因?qū)τ诹私庾訉m內(nèi)膜癌生物活性具有重要意義[18]。研究顯示，在鼻咽癌細胞中miR-140-5p能調(diào)控ADAM10蛋白水平，減少鼻咽癌細胞遷移及侵襲[19]。本研究結(jié)果顯示，通過過表達miR-143能夠抑制ADAM17蛋白水平減少HEC1B增殖，加快凋亡。說明升高miR-143水平，抑制HEC1B生物活性可能與抑制ADAM17水平相關(guān)，可能通過減少Notch 1信號逆轉(zhuǎn)ADAM17活性相關(guān)，但是具體機制還需要進一步探討[20]。

綜上所述，過表達miR-143模擬物能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細胞生物活性，抑制癌癥發(fā)展可能與抑制ADAM17基因表達相關(guān)。