周艷群 林玲云 陳本澍 王禮瓊 劉增慧

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，廣東廣州 510405

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是常見(jiàn)的惡性漿細(xì)胞增殖性疾病，是一種不可治愈的疾病，最終將復(fù)發(fā)[1]。從中醫(yī)方面尋求新思路、新方法越發(fā)得到重視。MM 屬于中醫(yī)學(xué)的“骨痹”范疇[2]。補(bǔ)腎活血方由桃仁、紅花、丹參、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、菟絲子、熟地黃、三七組成，該方是全國(guó)名老中醫(yī)丘和明在多年臨床經(jīng)驗(yàn)中總結(jié)出來(lái)的，主要用于腎虛血瘀型MM 患者?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血方在改善MM 患者骨痛癥狀、增強(qiáng)化療效果、增強(qiáng)免疫力[3]、保護(hù)腎功能[4]、改善骨代謝以護(hù)骨[5]等方面均發(fā)揮重要作用?；谇捌谘芯炕A(chǔ)上，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接方法，探索補(bǔ)腎活血方治療MM 的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，為后續(xù)的臨床應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 補(bǔ)腎活血方的活性成分及靶點(diǎn)挖掘

以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類(lèi)藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 作為潛在活性成分的篩選條件[6]，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）中篩選出補(bǔ)腎活血方符合條件的活性成分。在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并收集每個(gè)活性成分的Canonical SMILES 結(jié)構(gòu)式，并分別上傳至Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)，即可獲得與已知配體二維結(jié)構(gòu)相似度精確的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)[7]。

1.2 基因芯片獲取

在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“multiple myeloma”作為檢索詞，篩選出同時(shí)含有MM 和正常人骨髓樣本的人源基因芯片，文件編號(hào)：GSE113295，該芯片由12 例完全緩解MM 骨髓樣本和6 例正常樣本構(gòu)成。

1.3 差異表達(dá)基因的獲取與篩選

采用GEO2R 從基因芯片中篩選MM 患者與正常人骨髓的差異表達(dá)基因。并以P <0.05、兩組間表達(dá)量的比值（logFC）>1.5[8]為條件，篩選出MM 組織與正常組織中顯著上下調(diào)的基因。

1.4 “活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

將補(bǔ)腎活血方所含活性成分、潛在治療靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中，對(duì)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的度值、介數(shù)以及接近中心性進(jìn)行分析。

1.5 GO 生物過(guò)程及KEGG 通路富集分析

導(dǎo)入潛在靶蛋白的基因簡(jiǎn)稱(chēng)，通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)完成基因本體（gene ontology，GO）、京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析及圖形可視化，以P <0.05 和偽發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）<0.05 進(jìn)行評(píng)估[9]。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

運(yùn)用AutoDock Vina 對(duì)關(guān)鍵基因所對(duì)應(yīng)的靶蛋白與關(guān)鍵成分分別進(jìn)行對(duì)接，結(jié)合能＜0 kJ/mol 提示活性成分可與靶點(diǎn)蛋白自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能越低，表明活性成分與靶蛋白的結(jié)合力越強(qiáng)[10]，并對(duì)最佳結(jié)合構(gòu)像進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 MM 相關(guān)差異基因表達(dá)分析

通過(guò)對(duì)基因芯片GSE113295 進(jìn)行分析，獲取MM患者骨髓與正常人骨髓的基因表達(dá)譜中明顯改變的基因共1380 個(gè)。

2.2 補(bǔ)腎活血湯有效活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

以O(shè)B≥30%、DL≥0.18 為條件進(jìn)行檢索，得到補(bǔ)腎活血湯中活性成分共97 個(gè)（表1）?；钚猿煞诸A(yù)測(cè)到靶點(diǎn)7088 個(gè)。將7088 個(gè)靶點(diǎn)與1380 個(gè)差異表達(dá)基因取交集，剔除重復(fù)靶點(diǎn)后，獲得補(bǔ)腎活血湯治療MM 的潛在靶點(diǎn)98 個(gè)。

表1 補(bǔ)腎活血湯有效活性成分

2.3 “活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中，有195 個(gè)節(jié)點(diǎn)（活性成分節(jié)點(diǎn)97 個(gè)、靶基因節(jié)點(diǎn)98 個(gè)）和756 條邊。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[8]與本研究需求，取度值、介數(shù)以及接近中心性這3 個(gè)參數(shù)排名前9 位的基因交集，所得到的即為關(guān)鍵基因，分別為T(mén)NF、PPARG、NPC1L1、NOS2、MAPK14、ESR1、CSNK2A1、CDC25C、BRAF；同法獲取關(guān)鍵活性成分，分別為Methylcimicifugoside_qt、beta-carotene、Pyrethrin Ⅱ、Baicalin [黃芩苷、Stigmasterol、Daucos terol（即Eleutheroside A）]、Corylifolinin?！盎钚猿煞?靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖1，圖中圓形節(jié)點(diǎn)代表靶基因，三角形節(jié)點(diǎn)代表活性成分；節(jié)點(diǎn)顏色隨著度值漸變，節(jié)點(diǎn)顏色越深，表示節(jié)點(diǎn)度值越大；節(jié)點(diǎn)形狀隨介數(shù)值漸變，節(jié)點(diǎn)形狀越大，表示介數(shù)越大；節(jié)點(diǎn)標(biāo)簽字體大小隨接近中心性值漸變，標(biāo)簽字體越大，表示越接近中心網(wǎng)絡(luò)。

圖1 “活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO 及KEGG 富集分析結(jié)果

KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，信號(hào)通路共16 條（P ＜0.05，F(xiàn)DR ＜0.05），主要涉及癌癥信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)通路、破骨細(xì)胞分化通路、TNF信號(hào)通路等。富集所得信號(hào)通路詳細(xì)信息見(jiàn)圖2（封四）。

圖2 京都基 因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)通路

2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

7 個(gè)活性成分與9 個(gè)靶基因進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果提示靶蛋白與關(guān)鍵成分的結(jié)合能均≤-6.0 kJ/mol，其中結(jié)合能最低的2 種模式為Methylcimicifugoside_qt與MAPK14 結(jié)合（結(jié)合能為-15.1 kJ/mol），Methylcimicifugoside_qt與BRAF 結(jié)合（結(jié)合能為-13.3 kJ/mol），對(duì)以上2 種結(jié)合模式進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖3。

圖3 結(jié)合模式進(jìn)行可視化

3 討論

系統(tǒng)生物學(xué)是從整體視角認(rèn)識(shí)生物體的研究技術(shù)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)、基因組學(xué)等多組學(xué)聯(lián)合應(yīng)用，與中醫(yī)藥“整體觀”研究思路不謀而合[11]。在開(kāi)展名老中醫(yī)藥專(zhuān)家學(xué)術(shù)思想傳承研究時(shí)，除了師徒傳承模式外，系統(tǒng)生物學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、藥理學(xué)等多學(xué)科的交叉，更有利于名老中醫(yī)藥專(zhuān)家學(xué)術(shù)思想的傳承與探索[12]。β-胡蘿卜素是源于紅花的有效活性成分，PPARG 是癌癥信號(hào)通路中的重要靶點(diǎn)蛋白，β-胡蘿卜素聯(lián)合羅格列酮能通過(guò)PPARG 依賴(lài)的信號(hào)通路，增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化來(lái)維持骨代謝的正平衡[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)，β-胡蘿卜素能夠通過(guò)對(duì)PPARG 的調(diào)控，參與破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路，且分子對(duì)接結(jié)果提示，β-胡蘿卜素能夠與PPARG 良好結(jié)合。豆甾醇是補(bǔ)骨脂、當(dāng)歸、紅花、三七、山藥、熟地黃的共有活性成分，國(guó)外學(xué)者[14]研究發(fā)現(xiàn)，豆甾醇可通過(guò)下調(diào)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠NF-κB 信號(hào)通路的激活和p38MAPK 的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠的骨關(guān)節(jié)保護(hù)作用，與本研究結(jié)果一致。黃芩苷是紅花、山藥的共有活性成分，具有抑制MM 細(xì)胞的增殖、侵襲和促進(jìn)其凋亡的作用[15]。胡蘿卜苷是來(lái)自牛膝的活性成分，研究者發(fā)現(xiàn)胡蘿卜苷具有顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用，且呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系[16]。對(duì)“活性成分-靶點(diǎn)-KEGG 通路”網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)MAPK14、TNF、BRAF、PPARG、VEGFA、NOS2等關(guān)鍵基因是補(bǔ)腎活血方治療MM 的潛在靶基因。差異基因數(shù)據(jù)分析顯示，這些基因在MM 患者中是呈現(xiàn)出上調(diào)狀態(tài)；為了說(shuō)明潛在作用靶點(diǎn)在基因功能和信號(hào)通路中的作用，進(jìn)行了GO 功能富集和KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)這些靶基因可參與MAPK、NF-κB、破骨細(xì)胞活化、TNF、癌癥等信號(hào)通路。MAPK 信號(hào)通路是參與調(diào)控MM 細(xì)胞增殖的重要信號(hào)通路[17]，與骨代謝密切相關(guān)，廣泛參與了骨相關(guān)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)[18]。高水平BRAF 的表達(dá)，激活MAPK 信號(hào)通路[19]，刺激MM 細(xì)胞的增殖，阻止其凋亡[20]，并導(dǎo)致蛋白酶體抑制劑耐藥[21]。MAPK 還能夠通過(guò)影響NF-κB 信號(hào)通路介導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展[22]，抑制NF-κB 信號(hào)通路，可抑制MM 細(xì)胞增殖[23]。TNF 作為常見(jiàn)的炎癥因子，在異常骨吸收患者中高表達(dá)，下調(diào)TNF 基因的表達(dá)，可減少TNF 的生成，減少破骨細(xì)胞的形成，抑制骨破壞[24]。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，補(bǔ)腎活血方可能以MAPK 信號(hào)通路為核心，以β-胡蘿卜素、豆甾醇、黃芩苷、胡蘿卜苷為物質(zhì)基礎(chǔ)，通過(guò)NF-κB、破骨細(xì)胞分化、TNF 信號(hào)通路對(duì)MM 發(fā)揮抑制MM 細(xì)胞增殖、增強(qiáng)化療效果、減輕骨破壞作用，該結(jié)果有待進(jìn)行下一步具體的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。