劉 麗，蘇麗萍，路子揚(yáng)，季 敏，蘇天園，蒲紅偉

（新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2第一附屬醫(yī)院病理科，3遠(yuǎn)程醫(yī)學(xué)中心，4學(xué)科建設(shè)科，烏魯木齊 830011）

食管癌（esophageal carcinoma）在全球惡性腫瘤發(fā)病率中位居第八位，死亡率位居第六位，是我國較常見的消化道惡性腫瘤之一，主要的組織學(xué)類型有鱗癌和腺癌，其中鱗癌占90%以上[1]。由于食管癌早期臨床表現(xiàn)不典型，多數(shù)患者就診時(shí)已達(dá)到晚期，導(dǎo)致臨床治療效果欠佳。因此，腫瘤標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)對(duì)于臨床上食管鱗癌的診斷和治療具有重要意義。Otubain2（OTUB2）是卵巢腫瘤結(jié)構(gòu)域（OTU）家族的成員，是一種二氫泛素化酶，最早發(fā)現(xiàn)于果蠅的卵巢腫瘤基因中，它能夠參與機(jī)體的多種生物學(xué)活動(dòng)[2-3]，包括抑制病毒誘導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子3和NF-κB的活化[4]、提高人胰島β細(xì)胞存活率[5]及促進(jìn)DNA的損傷修復(fù)[6]等。有研究表明，OTUB2能夠促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌[7]、甲狀腺乳頭狀癌[8]、肝癌[9]的發(fā)展，在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)出異?；钴S狀態(tài)。同時(shí)OTUB2能夠與TAZ中的多聚泛素化鏈相互作用，使TAZ被激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和遷移[10]。TAZ又稱為WWTR1（含有WW結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1），位于Hippo信號(hào)通路的下游發(fā)揮核心效應(yīng),在食管鱗癌[11]、頭頸部鱗癌[12]、喉鱗癌[13]等腫瘤中TAZ可以作為Hippo信號(hào)通路中的核心作用靶點(diǎn)參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[14]。此外，TAZ介導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[15]在食管癌的發(fā)展進(jìn)程中也有著一定的促進(jìn)作用。

這兩種因子在腫瘤中顯示出異常的高活性，說明OTUB2與TAZ與腫瘤的發(fā)展有著密切聯(lián)系。本研究旨在觀察食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）中OTUB2與TAZ的表達(dá)情況及其與ESCC的臨床分期轉(zhuǎn)移及預(yù)后之間的關(guān)系，探討OTUB2、TAZ參與ESCC的發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制，為ESCC的診斷與治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2008-2018年收治的272例ESCC患者病理石蠟標(biāo)本及臨床病理信息。納入標(biāo)準(zhǔn):確診為ESCC且術(shù)前均未接受過任何針對(duì)腫瘤的放、化療等治療；臨床病理參數(shù)信息完整且組織標(biāo)本經(jīng)過HE染色及鏡下觀察確認(rèn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)無損壞。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他腫瘤轉(zhuǎn)移等病例；脫片造成的無法判斷免疫組化染色結(jié)果者。資料收集已通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（K201909-03）。

1.2 生物信息學(xué)分析利用TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫檢索分析OTUB2在食管癌中的表達(dá)情況；STRING數(shù)據(jù)庫檢索OTUB2與TAZ之間的互作關(guān)系。

1.3 試劑與方法Anti-OTUB2購自中國Bioss試劑有限公司，貨號(hào)：bs6236R；Anti-TAZ購自英國ABCM公司,貨號(hào)：ab242313；兩者稀釋濃度為1∶50，PBS、檸檬酸抗原修復(fù)液、山羊血清、過氧化氫、通用型二抗等均購自中國Bioss試劑有限公司。石蠟標(biāo)本切片3μm，烤片2 h，溫度60℃，石蠟切片經(jīng)二甲苯、無水乙醇梯度脫蠟，檸檬酸抗原修復(fù)，封閉后加一抗Anti-OTUB2及Anti-TAZ 4℃孵育過夜；第二日加通用型二抗，DAB顯色，蘇木素染色，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.4 結(jié)果評(píng)定結(jié)果采用雙盲法，由兩位具有診斷資質(zhì)的病理醫(yī)師閱片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野。評(píng)分由染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分比綜合計(jì)算得出，將染色強(qiáng)度分為未染色（無色）、弱染色（淡黃色）、中度染色（淺棕色）和強(qiáng)染色（深棕色），分別以0、1、2、3計(jì)分。陽性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)包括：陽性細(xì)胞占比為0%計(jì)0分，占比0%～30%計(jì)1分，占比30%～60%計(jì)2分，占比60%～90%計(jì)3分。根據(jù)染色指數(shù)（SI）將染色結(jié)果記錄為陰性0～3分，陽性4～9分，其中4～5分計(jì)為低度表達(dá)，6～7分計(jì)為中度表達(dá)，8～9分計(jì)為高度表達(dá)。染色指數(shù)＝陽性細(xì)胞所占百分比×染色強(qiáng)度。

1.5 生存分析電話隨訪收集患者術(shù)后生存信息,以患者死亡為終點(diǎn)事件，隨訪時(shí)間截至2019年12月31日。根據(jù)OTUB2、TAZ蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況繪制生存分析圖，患者中位總生存時(shí)間（OS）是指最初診斷為ESCC至死亡或最終隨訪的時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。采用Fisher確切概率法對(duì)單個(gè)樣本例數(shù)理論值<5的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；關(guān)聯(lián)性分析采用Spearman相關(guān)分析法，生存分析采用Kaplan-Meier分析法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析OTUB2在食管癌中的表達(dá)情況及其與TAZ的相互作用關(guān)系通過TCGA數(shù)據(jù)庫檢索分析發(fā)現(xiàn)，OTUB2在多種腫瘤中高表達(dá)，而在食管癌組織中表達(dá)顯著高于正常食管癌旁組織,見圖1a、b；利用STRING數(shù)據(jù)庫檢索OTUB2與TAZ（WWTR1）發(fā)現(xiàn)，兩者之間存在相互作用關(guān)系，見圖1c。

圖1 生物信息學(xué)分析OTUB2在食管癌中的表達(dá)及其與TAZ(WWTR1)之間的關(guān)系

2.2 OTUB2在ESCC中的表達(dá)情況及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系OTUB2在癌旁組織中呈陰性表達(dá)，見圖2a；在ESCC的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中OTUB2均呈現(xiàn)高表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，見圖2b～d；在癌旁組織中OTUB2陽性表達(dá)率為12.1%，ESCC中OTUB2陽性表達(dá)率為87.9%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。OTUB2的陽性表達(dá)與腫瘤大小（P=0.000）、分化程度（P=0.000）有關(guān)，與性別（P=0.065）、年齡（P=0.457）、浸潤深度（P=0.758）、TNM分期（P=0.362）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.185）無關(guān)，見表1。

表1 OTUB2在ESCC中的表達(dá)及臨床相關(guān)病理參數(shù)分析

圖2 OTUB2在ESCC組織及癌旁組織中的表達(dá)（×200）

2.3 TAZ在ESCC中的表達(dá)情況及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系TAZ在癌旁組織中不表達(dá)，見圖3a；在ESCC的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均呈陽性表達(dá),主要定位于細(xì)胞核，見圖3b～d。在癌旁組織中TAZ陽性表達(dá)率為14.1%，ESCC中TAZ陽性表達(dá)率為85.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。TAZ的陽性表達(dá)與腫瘤大?。≒=0.000）、分化程度（P=0.020）、浸潤深度（P=0.000）、TNM分期（P=0.005）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.023）有關(guān)，與性別（P=0.438）、年齡（P=0.795）無關(guān)，見表2。

圖3 TAZ在ESCC組織及癌旁組織中的表達(dá)（×200）

表2 TAZ在ESCC中的表達(dá)及臨床相關(guān)病理參數(shù)分析

2.4 OTUB2、TAZ在ESCC發(fā)展中的相關(guān)性O(shè)TUB2、TAZ共同陽性表達(dá)的病例數(shù)為175例（64.3%），OTUB2陽性表達(dá)TAZ陰性表達(dá)29例（10.7%），OTUB2陰性表達(dá)TAZ陽性表達(dá)45例（16.5%），兩者共同陰性表達(dá)23例（8.5%）。Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析顯示，OTUB2與TAZ表達(dá)呈正相關(guān)（P=0.000，r=0.216）。

2.5 OTUB2、TAZ在ESCC中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系生存分析結(jié)果表明，ESCC患者中OTUB2高表達(dá)組中位總生存時(shí)間（OS）為22個(gè)月，低表達(dá)組OS為30個(gè)月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.042)，見圖4a；腫瘤直徑≥3 cm的患者中，OTUB2高表達(dá)組OS值更短(P=0.032)，見圖4b。此外，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TAZ高表達(dá)組的OS值為23個(gè)月低于TAZ低表達(dá)組OS值28個(gè)月(P=0.033)，見圖4c；當(dāng)腫瘤直徑≥3 cm且TAZ高表達(dá)時(shí)，患者OS值較低(P=0.031)，圖4d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在臨床病理分期TNM I期和II期，TAZ的高表達(dá)在ESCC患者中傾向于較差的預(yù)后(P=0.016)，見圖4f；當(dāng)腫瘤浸潤全層以及存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且TAZ高度表達(dá)時(shí)，OS值較短(P<0.05)，見圖4e、g。當(dāng)OTUB2與TAZ同時(shí)為陰性表達(dá)時(shí)，OS值更長，患者的生存和預(yù)后最好，當(dāng)兩者中有一項(xiàng)為陽性表達(dá)或兩者均為陽性表達(dá)時(shí)，OS值更短，患者生存率較低，預(yù)后較差，見圖4h；當(dāng)腫瘤直徑≥3 cm且OTUB2與TAZ高表達(dá)時(shí)，患者生存率更低，預(yù)后亦越差，見圖4i。以上結(jié)果均表明，OTUB2與TAZ的表達(dá)水平與食管鱗癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。

圖4 OTUB2、TAZ在ESCC中表達(dá)水平的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

食管癌在全球惡性腫瘤的發(fā)病率及致死率中均位居前列，其惡性程度和侵襲轉(zhuǎn)移能力通常與癌細(xì)胞自身增殖分化能力有著緊密聯(lián)系，當(dāng)抑癌基因和促癌基因表達(dá)失衡時(shí)可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移等[16]。

OTUB2是一種去泛素化酶，可作為一種腫瘤干細(xì)胞和轉(zhuǎn)移促進(jìn)因子，有研究發(fā)現(xiàn)OTUB2在賴氨酸233上是聚-SUMO化的，而TAZ中可能存在一個(gè)能夠與SUMO相互作用的結(jié)構(gòu)域(SUMO-interacting motif，SIM)，TAZ可通過該結(jié)構(gòu)域與SUMO（small ubiquitinrelated modifier）化的OTUB2相結(jié)合而發(fā)揮效應(yīng)[10]。OTUB2能夠通過去泛素化酶的作用調(diào)控增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）從而促進(jìn)細(xì)胞生長增殖[17]。而TAZ在與細(xì)胞中的scribble（細(xì)胞極性決定因子）形成復(fù)合物抑制其原有的腫瘤相關(guān)分子生物學(xué)功能；在腫瘤細(xì)胞中由于scribble被大量破壞,或Hippo通路中上游核心激酶異常,使通路中上游因子對(duì)TAZ的抑制作用解除,從而使TAZ具有腫瘤干細(xì)胞的特征和功能[18]。其參與腫瘤發(fā)展主要機(jī)制為在正常細(xì)胞生長過程中TAZ主要以磷酸化形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)受到某些內(nèi)外環(huán)境因素刺激時(shí)，可使其磷酸化減弱，去磷酸化增強(qiáng)，由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子TEAD1-4結(jié)合從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。有資料表明，TAZ在多種腫瘤中呈現(xiàn)出異常的高活性，并且與腫瘤的遷移和侵襲能力密切相關(guān)，在非小細(xì)胞肺癌中沉默TAZ后能夠顯著降低癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力[19]；在食管鱗癌組織中，TAZ呈高表達(dá)且與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[12]，這與本研究結(jié)果一致。

Zhang[10]等發(fā)現(xiàn)，OTUB2可作為一個(gè)重要的調(diào)制器調(diào)控TAZ的表達(dá)從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，其可通過去泛素化作用結(jié)合和穩(wěn)定TAZ，對(duì)TAZ有著一定的正向調(diào)節(jié)作用，該團(tuán)隊(duì)的研究發(fā)現(xiàn)OTUB2能夠不依賴Hippo信號(hào)通路直接作用于TAZ從而促進(jìn)腫瘤的增殖，當(dāng)OTUB2過表達(dá)時(shí)可直接通過SUMO化穩(wěn)定和結(jié)合TAZ使其激活，TAZ去磷酸化作用增強(qiáng)并且轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與核內(nèi)TEADs結(jié)合激活相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，而對(duì)于OTUB2與TAZ在ESCC中的作用機(jī)制仍需更深入的研究。本研究利用生物信息學(xué)分析OTUB2在食管癌中的表達(dá)情況以及與TAZ的相互作用關(guān)系，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測分析OTUB2與TAZ在ESCC組織及癌旁組織中的表達(dá)水平及其相關(guān)性。結(jié)果表明，OTUB2和TAZ在ESCC組織的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，并且與患者的臨床參數(shù)及預(yù)后相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過相關(guān)性分析得出，OTUB2與TAZ在ESCC中表達(dá)有關(guān)聯(lián)性并呈正相關(guān)。生存分析結(jié)果表明，OTUB2與TAZ高表達(dá)組的ESCC患者OS明顯短于低表達(dá)組（P<0.05）。由此可推斷，OTUB2與TAZ可能參與了ESCC的發(fā)生、發(fā)展并有一定的促進(jìn)作用。

綜上所述，OTUB2、TAZ的蛋白表達(dá)水平與ESCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但對(duì)于OTUB2與TAZ在ESCC組織中的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究與探索，這將為ESCC的早期發(fā)現(xiàn)與治療提供新的治療靶點(diǎn)。