陳 罕，孫肖爽，李紅杰，李宗樹(shù)，李 晶，魏愛(ài)宣，徐忠信

(1.長(zhǎng)春市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130051；2.吉林省人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科；3.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室；4.吉林市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科；5.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科)

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是NAD+依賴性蛋白脫乙酰酶，在氧化應(yīng)激、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種重要的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。SIRT1是維持正常認(rèn)知所必需[2]，并參與阿爾茨海默病(AD)等神經(jīng)變性病所致的認(rèn)知損傷[3]。最近的氧糖剝奪體外實(shí)驗(yàn)、急性腦缺血和缺血預(yù)處理動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明SIRT1通過(guò)抗氧化等機(jī)制在急性缺血缺氧腦內(nèi)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4-5]，提示SIRT1與血管性認(rèn)知損傷可能存在密切相關(guān)性。本研究對(duì)慢性腦缺血后大鼠腦內(nèi)SIRT1水平及氧化應(yīng)激指標(biāo)進(jìn)行了多時(shí)間點(diǎn)連續(xù)性檢測(cè)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康雄性Wistar大鼠，2-3個(gè)月齡，體重260-300克，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分組如下：(1)假手術(shù)6周組(n=7)、9周組(n=6)、12周組(n=6)，(2)慢性腦缺血6周組(n=7)、9周組(n=6)、12周組(n=6)。

1.2 模型制作

采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎方法(2-VO)制備慢性腦缺血大鼠模型，使用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端和近端進(jìn)行雙重結(jié)扎，同時(shí)剪斷大鼠尾末端。假手術(shù)組僅分離暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈而不結(jié)扎。術(shù)后連續(xù)3天肌肉注射青霉素20萬(wàn)U/Kg。

1.3 認(rèn)知功能評(píng)測(cè)

利用Morris水迷宮試驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行認(rèn)知功能評(píng)測(cè)。定位航行試驗(yàn)每天進(jìn)行2次試驗(yàn)，連續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)5天。定位航行試驗(yàn)全部完成后，于當(dāng)天立即進(jìn)行2次空間探索試驗(yàn)。

1.4 免疫組化檢測(cè)

免疫組化染色用SP法進(jìn)行，利用HPLAS-1000彩色病理圖文分析系統(tǒng)于×400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算SIRT1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比率，以平均值作為最終判定指標(biāo)。

1.5 蛋白印跡(Western blot)

對(duì)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)大鼠進(jìn)行迅速斷頭取腦進(jìn)行總蛋白提取。用0.2%的TBS稀釋SIRT1一抗(1∶300)，DAB試劑盒顯色，凝膠成像及分析系統(tǒng)掃描，Quantity one v4.62定量分析。以目的蛋白與相應(yīng)β-actin條帶凈光密度的比值，表示各組蛋白表達(dá)水平。

1.6 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

10%的腦組織勻漿，4 000 r/min，離心10 min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行SOD、MDA水平測(cè)定(南京建成生物工程研究所)。

1.7 主要試劑

兔抗鼠SIRT1單克隆IgG抗體(#9475)購(gòu)自Cell Signaling TECHNOLOGY，羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(ZB-2301)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SP試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物制品公司，SOD、MDA試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 慢性腦缺血大鼠不同時(shí)間點(diǎn)學(xué)習(xí)及記憶能力變化

術(shù)后6周、9周、12周2-VO組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，與假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期比較差異明顯(圖1A，P<0.01)?？臻g探索試驗(yàn)中3個(gè)時(shí)間點(diǎn)2-VO組大鼠跨越原平臺(tái)所在象限時(shí)間均明顯小于假手術(shù)組，并隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸縮短，提示其學(xué)習(xí)記憶能力下降(圖1B，P<0.01)。

圖1 Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果 A.定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期對(duì)比(與假手術(shù)組對(duì)比*P<0.01) B.空間探索試驗(yàn)跨原平臺(tái)所在象限時(shí)間對(duì)比(與假手術(shù)組對(duì)比*P<0.01，與6周組#P<0.01，與9周組對(duì)比ΔP<0.01)

2.2 慢性腦缺血大鼠腦內(nèi)SIRT1表達(dá)水平變化

免疫組化顯示SIRT1在細(xì)胞內(nèi)被染成棕黃色或棕褐色，主要表達(dá)于細(xì)胞核，胞漿偶見(jiàn)表達(dá)。假手術(shù)組SIRT1表達(dá)相對(duì)較多，2-VO術(shù)后SIRT1表達(dá)明顯減少(P<0.05)，染色變淡，以缺血6周組最明顯(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 海馬CA1區(qū)SIRT1免疫組化結(jié)果(SP，×400，與假手術(shù)組比較*P<0.05；與缺血6周比較#P<0.05，與缺血9周比較ΔP<0.05)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示2-VO術(shù)后6周、9周、12周SIRT1的蛋白水平均低于相應(yīng)對(duì)照組(P<0.01)，6周時(shí)最明顯(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 海馬CA1區(qū)SIRT1蛋白Western blot檢測(cè)結(jié)果(與假手術(shù)組比較*P<0.01，與6周組比較#P<0.01，與9周組比較ΔP<0.01)

2.3 慢性腦缺血大鼠不同時(shí)間點(diǎn)SOD及MDA水平變化

2-VO組大鼠SOD水平術(shù)后6周明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)，MDA水平明顯高于對(duì)應(yīng)假手術(shù)組(P<0.05)，術(shù)后9周及12周與假手術(shù)組比較無(wú)顯著性差異(圖4)。

圖4 2-VO術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)SOD及MDA水平變化(與假手術(shù)組比較*P<0.05)

3 討論

在阿爾茨海默病、亨廷頓病和其他退行性疾病中，SIRT1相關(guān)信號(hào)通路對(duì)認(rèn)知障礙的神經(jīng)保護(hù)作用已被大量的研究證實(shí)[3，6]。本研究在慢性腦缺血大鼠腦內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)連續(xù)檢測(cè)SIRT1的活性，結(jié)果顯示2-VO術(shù)后的6周、9周和12周慢性腦缺血大鼠的認(rèn)知損傷持續(xù)存在。術(shù)后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的免疫組化和Western blot 結(jié)果提示SIRT1蛋白表達(dá)持續(xù)下降，以術(shù)后6周時(shí)下降最為明顯，提示SIRT1表達(dá)在慢性腦缺血中受到抑制并以缺血后早期為著。研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)SIRT1的蛋白減少了45%[7]。在急性卒中、缺血再灌注等腦部模型中也已經(jīng)證實(shí)了SIRT1降低與神經(jīng)功能缺損相關(guān)。在MCAO誘導(dǎo)的腦缺血大鼠模型中，缺血半暗帶區(qū)SIRT1的mRNA和蛋白表達(dá)水平在恢復(fù)灌注后1小時(shí)至24小時(shí)持續(xù)性降低[7]。在本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)時(shí)定量PCR顯示SIRT1的mRNA水平并未受到慢性腦缺血的影響，表明慢性腦缺血對(duì)大鼠腦中SIRT1活性影響未發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，而是轉(zhuǎn)錄后水平，這與Schirmer在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致[8]。

氧化應(yīng)激損傷與認(rèn)知障礙的相關(guān)性已是眾多學(xué)者的共識(shí)[9]。許多研究也表明氧化應(yīng)激參與慢性腦缺血的發(fā)病[10-11]。Mirshafa等發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后10天大鼠腦內(nèi)SOD水平下降，而MDA水平升高[12]。作為體內(nèi)清除氧自由基的特異酶，SOD在缺血性卒中的神經(jīng)元的命運(yùn)和損傷發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。本研究動(dòng)態(tài)觀察了2-VO術(shù)后6周、9周及12周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)，結(jié)果顯示慢性腦缺血時(shí)SOD降低及MDA升高，提示慢性腦缺血時(shí)體內(nèi)抗氧化能力降低、氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。更為重要的是，這一顯著差異僅發(fā)生在腦缺血術(shù)后6周，提示氧化應(yīng)激反應(yīng)主要發(fā)生在慢性腦缺血早期階段。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)SIRT1通過(guò)氧化應(yīng)激參與多種年齡相關(guān)性疾病，它可以通過(guò)FOXO及PGC1α等多個(gè)信號(hào)通路參與細(xì)胞應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)[14-15]。本研究觀察到SIRT1蛋白在慢性腦缺血早期階段下降最為明顯，恰恰與SOD、MDA顯著改變時(shí)間點(diǎn)相同，提示SIRT1可能通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)早期參與慢性腦缺血所致的認(rèn)知損傷。