趙曉寧，劉志遠(yuǎn)，劉江波，李 綱，張松雨，張金盈

(1.南陽市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科，河南 南陽473009；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，河南 鄭州450052)

急性心肌梗死(AMI)是由于冠狀動脈供血不足引起的心肌缺血缺氧性疾病，在歐美國家具有較高的發(fā)病率，近年來我國AMI也呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢[1-2]。瑞舒伐他汀(RSV)目前常用于高脂血癥、冠心病等疾病預(yù)防，還具有降血脂、抗炎、抗氧化以及免疫調(diào)節(jié)等作用[3]。已有研究表明RSV可以降低AMI細(xì)胞凋亡，改善AMI心室重塑以及心功能損害作用。尿激酶原(pro-UK)對纖維蛋白纖溶酶原具有激活作用，具有溶栓功能，與傳統(tǒng)的溶栓藥物相比具有不良反應(yīng)小、療效顯著等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。目前pro-UK聯(lián)合RSV對AMI心肌影響的相關(guān)報道較少，本研究通過制備AMI大鼠模型，探索pro-UK聯(lián)合RSV對其心肌組織可能存在的影響，希望能為AMI藥物治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與動物

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠，雄性，60只，4-5周齡，體質(zhì)量(250±20)g，無特定病原體(SPF)級別，購自南方醫(yī)科大學(xué)【許可證號，SCXK(粵)2016-0041】，在SPF級飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，購回后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，符合動物3R標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑及儀器 Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、cleaved-Caspase-3抗體(上海恒斐生物科技有限公司)，瑞舒伐他汀(阿斯利康生物制藥有限公司)，尿激酶原(上海熹垣生物科技有限公司)，氯化三苯硝基四氮唑紅(TTC)(上海源葉生物科技有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)，腫瘤壞死因子-ɑ(TNF-ɑ) ELISA試劑盒(上海恪敏生物科技有限公司)。冷凍離心機(jī)(EXPERT 15K-R，湖南吉爾森科技發(fā)展有限公司)，石蠟切片機(jī)(HM325，英國賽默飛公司)，顯微鏡(XDS-800C，上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1分組及模型制備 將60只SD大鼠按體重隨機(jī)均分為假手術(shù)組、模型組、RSV組、RSV+尿激酶原組，其中模型組、RSV組、RSV+尿激酶原組用于AMI模型制備，參考文獻(xiàn)[6]運(yùn)用結(jié)扎左冠動脈前降支方法制備AMI模型，并且各組大鼠在術(shù)后腹腔注射40萬單位青霉素，連續(xù)5 d，預(yù)防術(shù)后感染，假手術(shù)組大鼠只進(jìn)行至穿線步驟但不進(jìn)行結(jié)扎。RSV組、RSV+尿激酶原組術(shù)后次日灌胃RSV，劑量為1 mg/(kg·d)；RSV+尿激酶原組增加尿激酶原干預(yù)，首次進(jìn)行靜脈注射尿激酶原1 mg/kg，之后靜脈注射0.25 mg/(kg·d)，一周一次，假手術(shù)組、模型組大鼠均灌胃相同體積生理鹽水，連續(xù)干預(yù)4周。

1.2.2樣品采集 末次干預(yù)結(jié)束后24 h，然后再對各組大鼠的血流動力學(xué)進(jìn)行檢測，檢測完成后，再將各組大鼠麻醉處死，迅速取出完整的心臟組織，分別用于心肌梗死、心肌組織HE染色、TUNEL凋亡、心肌組織氧化應(yīng)激及炎性因子水平以及Western blot檢測。

1.2.3血流動力學(xué)檢測 將導(dǎo)管經(jīng)右頸總動脈插入左心室，記錄各組大鼠的平均動脈壓(MAP)，左心室的收縮壓(LVSP)、舒張末壓(LVEDP)、內(nèi)壓下降的最大速率(LV-dp/dtmax)、內(nèi)壓上升的最大速率(LV+dp/dtmax)。

1.2.4TTC/Evans blue檢測 將取出心臟置于預(yù)冷4℃生理鹽水中洗滌，洗凈血液，并向左心室中灌入Evans blue溶液2 mL、染色2 h，其中未染色區(qū)即為狹窄冠脈支配的缺血區(qū)，灌入2%瓊脂于4℃冷卻至凝固，并將心肌組織切成3 mm厚切片，2%TTC染色20 min，其中鮮紅色區(qū)域?yàn)槲窗l(fā)生的壞死區(qū)域，未著色區(qū)為壞死區(qū)域，采用4%多聚甲醛固定24 h，然后采用Image J對心肌組織梗死區(qū)域、缺血危險區(qū)的面積進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5HE染色 4%多聚甲醛中固定心肌組織，常規(guī)石蠟包埋，切成4 μm，蘇木精、伊紅染色，中性樹膠封片，觀察心肌組織病理變化[7]。重復(fù)3次。

1.2.6氧化應(yīng)激及炎性因子水平檢測 取0.5 g心肌組織，加入組織細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑，研磨成組織勻漿，3 000 r/min，離心20 min，取上清液，采用ELISA檢測心肌組織中MDA、SOD、IL-6、TNF-ɑ水平。重復(fù)3次。

1.2.7TUNEL檢測心肌組織凋亡 常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟，蛋白酶K修復(fù)20 min，3 % H2O2室溫5 min，PBS洗2次，TdT酶于37 ℃反應(yīng)60 min，PBS洗3次，氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作溶液反應(yīng)30 min，PBS洗4次，0.05% DAB顯色4 min，蒸餾水洗4次，蘇木精復(fù)染10 min，蒸餾水洗3次，脫水，透明，封片。每張片子選取5個視野，記錄陽性細(xì)胞數(shù)，取其均數(shù)作為該組陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞表現(xiàn)為核黃色或者棕褐色顆粒。重復(fù)3次。

1.2.8Western blot檢測 取0.5 g心肌組織，蛋白提取試劑盒對各組大鼠心肌組織的總蛋白進(jìn)行提取，Bradford蛋白定量，SDS-PAGE分離，將30 μg蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜、室溫密封2 h，洗膜并加一抗(Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3、GAPDH，1∶500)4℃孵育過夜，TBST緩沖液漂洗40 min，然后加入HRP標(biāo)記二抗(1∶500)，37℃孵育2 h，ECL顯色，收集條帶影像。重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，one-way ANOVA檢驗(yàn)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時，兩兩組間的差異比較用LSD-t檢驗(yàn)，SPSS 22.0軟件，檢驗(yàn)水平ɑ=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的血流動力學(xué)變化與假手術(shù)組相比，模型組的MAP、LVSP、LV-dp/dtmax、LV+dp/dtmax均降低(P<0.05)，LVEDP升高(P<0.05)；與模型組相比，RSV組、RSV+尿激酶原組的MAP、LVSP、LV-dp/dtmax、LV+dp/dtmax均升高(P<0.05)，LVEDP降低(P<0.05)；RSV組、RSV+尿激酶原組的MAP、LVSP、LVEDP、LV-dp/dtmax、LV+dp/dtmax比較差異不顯著(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠的血流動力學(xué)變化

2.2 pro-UK聯(lián)合RSV對AMI大鼠心肌梗死及病理結(jié)構(gòu)的影響假手術(shù)組大鼠的心肌組織細(xì)胞排列整齊、細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、未出現(xiàn)明顯的病理變化，模型組大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)炎性浸潤、壞死以及排列不規(guī)則，RSV組、RSV+尿激酶原組心肌細(xì)胞排列情況、細(xì)胞損傷情況、炎性浸潤較模型組明顯減輕，病理情況得到改善，見圖1。與模型組相比，RSV組、RSV+尿激酶原組大鼠心肌組織相對梗死面積均降低(P<0.05)；RSV+尿激酶原組大鼠心肌組織相對梗死面積低于RSV組(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠的心肌相對梗死面積比較

圖1 各組大鼠心肌組織病理變化(×200)

2.3 pro-UK聯(lián)合RSV對AMI大鼠心肌氧化應(yīng)激與炎性因子水平的影響與假手術(shù)組相比，模型組的MDA、IL-6、TNF-ɑ水平均升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)；與模型組相比，RSV組、RSV+尿激酶原組的MDA、IL-6、TNF-ɑ水平均降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)；與RSV組相比，RSV+尿激酶原組的MDA、IL-6、TNF-ɑ水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)。見表3。

表3 pro-UK聯(lián)合RSV對AMI大鼠心肌氧化應(yīng)激與炎性因子水平的影響

2.4 pro-UK聯(lián)合RSV對AMI大鼠心肌組織凋亡的影響TUNEL檢測結(jié)果顯示，與模型組相比，RSV組、RSV+尿激酶原組大鼠心肌組織凋亡率均降低(P<0.05)；RSV+尿激酶原組大鼠心肌組織凋亡低于RSV組(P<0.05)，見圖2、表4。與假手術(shù)組相比，模型組Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組相比，RSV組、RSV+尿激酶原組大鼠心肌組織中的Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)；與RSV組相比，RSV+尿激酶原組大鼠心肌組織中的Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，見圖3、表5。

圖2 各組大鼠心肌組織TUNEL檢測結(jié)果(×200)

圖3 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3凝膠成像結(jié)果(×200)

表4 各組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率比較

表5 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3水平比較

3 討論

AMI是臨床缺血性疾病死亡原因之一，不但給患者帶來心理壓力，而且還會增加收治患者的經(jīng)濟(jì)壓力[8-9]。RSV是一種具有調(diào)脂、非調(diào)脂作用的他汀類新型藥物，非調(diào)脂作用主要體現(xiàn)抗氧化、抗炎、抗心肌細(xì)胞肥大以及調(diào)控細(xì)胞凋亡、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，能夠抑制AMI后的心室重構(gòu)并且改善心室功能[10-11]。尿激酶原屬于絲氨酸蛋白酶類，分子約為49 kD，具有4個酶切位點(diǎn)，其本身的活性較低且在血漿中只有微弱活性，當(dāng)?shù)竭_(dá)血栓后，經(jīng)纖溶酶激活后，部分可轉(zhuǎn)化為雙鏈UK，部分因結(jié)合在血栓表面致其構(gòu)型發(fā)生改變轉(zhuǎn)化為纖溶酶，促進(jìn)血栓纖維蛋白溶解[12-13]。本研究結(jié)果顯示，AMI大鼠的血流動力存在MAP、LVSP、LV-dp/dtmax、LV+dp/dtmax明顯升高趨勢，而LVEDP呈現(xiàn)出明顯降低趨勢，舒伐他汀、尿激酶原聯(lián)合RSV干預(yù)后可以明顯改善AMI大鼠的血流動力學(xué)情況。Yao等[14]認(rèn)為重組尿激酶原對PPCI術(shù)后冠狀動脈血流的改善效果明顯，其療法與替羅非班具有相似安全性。由此推測，尿激酶原聯(lián)合RSV可以改善AMI大鼠的血流動力學(xué)情況。

AMI發(fā)生機(jī)制最早有血栓學(xué)說、炎癥學(xué)說、脂質(zhì)浸潤及氧化應(yīng)激學(xué)說等，由此表明AMI的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜[15-16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMI模型組大鼠的心肌梗死面積增加，并且心肌組織細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，由此表明AMI大鼠心肌組織存在嚴(yán)重?fù)p傷。經(jīng)RSV、尿激酶原聯(lián)合RSV干預(yù)后，AMI大鼠的心肌梗死面積降低，心肌組織細(xì)胞病理情況得到改善，并且尿激酶原聯(lián)合RSV干預(yù)后的改善情況更顯著。由此推測，尿激酶原聯(lián)合RSV對AMI大鼠心肌組織的改善作用可能與影響炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示AMI大鼠心肌組織中的MDA、IL-6、TNF-ɑ水平升高，SOD活性降低，而RSV、尿激酶原聯(lián)合RSV干預(yù)后，心肌組織中的MDA、IL-6、TNF-ɑ水平降低，SOD活性升高。MDA是脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，SOD可以清除自由基，單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞可合成分泌IL-6、TNF-ɑ，IL-6可誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-ɑ，加重機(jī)體炎癥反應(yīng)。TNF-ɑ可以在衰竭心肌組織中表達(dá)，并且與臨床血流動力嚴(yán)重程度有關(guān)，TNF-ɑ高表達(dá)會促進(jìn)心肌肥大、心室重塑以及心肌細(xì)胞凋亡[17]。已有研究[18]表明，RSV可以通過抑制IL-6、TNF-ɑ等炎性介質(zhì)的釋放，從而降低AMI大鼠的心肌纖維程度，進(jìn)而改善AMI大鼠的心室功能。有研究[19]顯示重組人尿激酶原聯(lián)合RSV可以降低AMI患者PCI術(shù)后炎性因子水平，改善患者預(yù)后。由此表明，尿激酶原聯(lián)合RSV可以調(diào)節(jié)AMI大鼠心肌組織氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)，但其作用機(jī)制還需要深入研究。

AMI可以引起心肌組織出現(xiàn)功能障礙，激活體內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，引起內(nèi)源性的氧化物質(zhì)水平增加，誘導(dǎo)體內(nèi)凋亡途徑活化，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于假手術(shù)組，而且心肌組織中Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平檢測結(jié)果也表明模型組大鼠心肌組織中的Bcl-2蛋白水平降低，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平升高，由此表明AMI大鼠存在心肌組織凋亡損傷。RSV、尿激酶原聯(lián)合RSV干預(yù)之后，發(fā)現(xiàn)AMI大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白水平升高，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平降低。Bcl-2、Bax是Bcl-2家族中與細(xì)胞凋亡相關(guān)的重要成員，兩者結(jié)合后可形成異構(gòu)二聚體或者是共同調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子含量，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用[20-21]。Caspase-3位于凋亡級聯(lián)反應(yīng)下游，是細(xì)胞凋亡通路的最終執(zhí)行者[22]。RSV可以有效抑制AMI大鼠的心肌細(xì)胞凋亡[23]，由此推測其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)基因caspase-3表達(dá)量有關(guān)。

綜上所述，本文通過大鼠模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)RSV、尿激酶原聯(lián)合RSV均對AMI大鼠的心肌梗死面積、心肌組織凋亡情況、以及血流動力學(xué)具有改善作用，并且尿激酶原聯(lián)合RSV在心肌梗死面積、心肌組織凋亡方面的改善作用更顯著。本文的研究結(jié)果只表明尿激酶原聯(lián)合RSV對AMI大鼠心肌損傷有改善作用，但其中的具體作用機(jī)制、在臨床中是否也具有相似的效果還需要及進(jìn)一步研究。