盛 琦 王國濤 徐道劍

腦缺血是全世界發(fā)病率高和死亡率高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn)，長時間嚴(yán)重缺血會導(dǎo)致神經(jīng)細胞丟失、認(rèn)知和運動功能障礙[1]。目前臨床采取溶栓法治療腦缺血，但溶栓后的血液再灌注會進一步通過誘導(dǎo)活性氧（reactive oxygen species，ROS）加重缺血區(qū)組織的損傷，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）[2]。因此，使用抗氧化劑或激活抗氧化通路誘導(dǎo)劑是治療腦缺血/再灌注的有效策略。二甲雙胍為雙胍類口服降血糖藥，臨床上用于肥胖的2型糖尿病[3]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血/再灌注模型中，二甲雙胍可減少神經(jīng)損傷，促進神經(jīng)細胞增殖和分化，減輕腦缺血/再灌注損傷[4]。Zhao 等[5]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍通過激活A(yù)MPK 通路保護PC12 細胞和海馬神經(jīng)元免受過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的氧化損傷，但二甲雙胍對氧化應(yīng)激的潛在保護作用及其機制需要進一步研究闡明。本研究通過建立H2O2誘導(dǎo)PC12 細胞氧化損傷模型探討二甲雙胍抗氧化機制，報道如下。

1 實驗材料

1.1 細 胞 大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細胞（PC12 細胞）購于中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2 藥 物 二甲雙胍（規(guī)格：1g/支，批號N304300，上海阿拉丁試劑有限公司）。

1.3 試 劑 CCK-8 試劑盒（批號C0037）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號C0016）、Hoechst 33342染色液（批號C1025）和ROS 檢測試劑盒（批號S0033S）購自碧云天生物有限公司。qRT-PCR 引物合成和Lipofectamine 2000 由賽默飛購得；核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）（批號12721）、血紅素加氧酶-1（HO-1）（批號86806）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，批號5174）購自Cell Signaling 公司；胎牛血清（批號30044333）購自Gibco 公司；H2O2（批號H112517）和多聚甲醛（批號C104188）購自上海阿拉丁有限公司。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng) 將PC12 細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100μg/mL 鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)待使用。

2.2 細胞分組 將PC12 細胞分別設(shè)置五組，DMSO組，H2O2組，二甲雙胍低（0.5mmol/L）、中（1mmol/L）、高（2mmol/L）劑量組。

2.3 細胞活力檢測 取對數(shù)生長期的PC12 細胞接種在96 孔板上，并放置過夜。用不同濃度二甲雙胍（0.5、1 和2mmol/L）處理24h 后，再用100μmol/L H2O2處理24h。將10μL 的CCK-8 溶液添加到每個孔中，將細胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h，并通過自動酶標(biāo)儀對450nm 處的吸光度進行定量，最后計算每組細胞活力的相對百分?jǐn)?shù)。

2.4 LDH 測定 取對數(shù)生長期的PC12 細胞接種在96 孔板上，并放置過夜。用不同濃度（0.5、1 和2mmol/L）的二甲雙胍處理24h 后，再用100μmol/L H2O2處理24h，然后根據(jù)說明書的實驗步驟確定每組培養(yǎng)基中釋放的LDH 的活性。

2.5 Hoechst 33342 染色法檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的PC12 細胞接種在6 孔板上，并放置過夜。用不同濃度（0.5、1 和2mmol/L）二甲雙胍處理24h后，再用100μmol/L H2O2處理24h。在4℃下用4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水固定10min，然后將細胞與Hoechst 33342 染色液孵育20min 以染色細胞核。用PBS 洗滌2 次后，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞，計算每組凋亡率。

2.6 ROS 水平測定 取對數(shù)生長期的PC12 細胞接種在6 孔板上，并放置過夜。用不同濃度（0.5、1 和2mmol/L）二甲雙胍處理24h 后，再用100μmol/L H2O2處理3h。室溫避光加入DCFH-DA 后孵育30min。細胞消化并用PBS 沖洗，離心，通過流式儀檢測ROS 含量，計算每組ROS 的水平。

2.7 Nrf2 和HO-1 mRNA 水平測定 取對數(shù)生長期的PC12 細胞接種在6 孔板上，并放置過夜。用不同濃度二甲雙胍（0.5、1 和2mmol/L）處理24h 后，收集細胞，用TRIzol 試劑提取總RNA 并檢測RNA 的質(zhì)量和數(shù)量。然后，用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄及進行進一步的PCR 反應(yīng)，最后計算每組的相對mRNA 含量，GAPDH 被用作內(nèi)部對照。其中引物序列見表1。

表1 基因引物序列

2.8 Nrf2 和HO-1 蛋白水平測定 取對數(shù)生長期的PC12 細胞接種在6 孔板上，并放置過夜。用不同濃度二甲雙胍（0.5、1 和2mmol/L）處理48h 后，裂解蛋白并收集蛋白，變性得到蛋白樣品。將等量蛋白質(zhì)的樣品在聚丙烯酰胺凝膠上分離，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，并分別用Nrf2 和HO-1 一抗在4℃孵育過夜。TBST 洗滌膜后，用二抗在室溫下孵育1.5h，洗滌后于ECL 孵育顯影凝膠成像系統(tǒng)中曝光成像，使用ImageJ 軟件對每組條帶的強度進行定量分析。

2.9 沉默Nrf2基因測定細胞保護作用 取對數(shù)生長期的PC12 細胞接種在6 孔板上，并放置過夜。將稀釋的siRNA 和Lipfectamine2000 試劑混合均勻，室溫下放置20min，再將混合液加入到6 孔板中；加入不同濃度（0.5、1 和2mmol/L）二甲雙胍孵育16h，再加入H2O2損傷24h。用MTT 溶液在37℃處理細胞。甲瓚晶體溶解，并通過自動酶標(biāo)儀對450nm 處的吸光度進行定量，計算每組細胞活力的相對百分?jǐn)?shù)。siRNA 引物序分別如下：siRNA Nrf2：上游引物5'-GGGUAAGUCGAGAAGUGUUTT-3'，下游引物5'-AACACUUCUCGACUUACCCTT-3'。

2.10 統(tǒng)計學(xué)方法 每組實驗重復(fù)3 次，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，應(yīng)用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)整理分析，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較使用t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 二甲雙胍對PC12 細胞的損傷作用 與DMSO組比較，隨著濃度的遞增，二甲雙胍對PC12 細胞毒副作用減弱（P＜0.05）。見表2。

表2 二甲雙胍對PC12 細胞的損傷作用（%，±s）

表2 二甲雙胍對PC12 細胞的損傷作用（%，±s）

注：DMSO 組為DMSO 處理；二甲雙胍低劑量組為0.5mmol/L 二甲雙胍處理；二甲雙胍中劑量組為1mmol/L 二甲雙胍處理；二甲雙胍高劑量組為2mmol/L 二甲雙胍處理；DMSO 為二甲基亞砜；與DMSO 組比較，aP＜0.05

3.2 二甲雙胍對H2O2誘導(dǎo)PC12 細胞損傷的保護作用 與H2O2組比較，隨著濃度增加二甲雙胍能依賴性提高H2O2誘導(dǎo)PC12 細胞的細胞活力（P＜0.05）。見表3。

表3 二甲雙胍對H2O2 誘導(dǎo)PC12 細胞損傷的保護作用（%，±s）

表3 二甲雙胍對H2O2 誘導(dǎo)PC12 細胞損傷的保護作用（%，±s）

注：DMSO 組為DMSO 處理；H2O2 組為H2O2 處理；二甲雙胍低劑量+H2O2 組為0.5mmol/L 二甲雙胍+H2O2 處理；二甲雙胍中劑量+H2O2組為1mmol/L 二甲雙胍+H2O2 處理；二甲雙胍高劑量+H2O2 組為2mmol/L 二甲雙胍+H2O2 處理；DMSO 為二甲基亞砜；與DMSO 組比較，aP＜0.05；與H2O2 組比較，bP＜0.05

3.3 二甲雙胍減少H2O2作用下LDH 的釋放量 與DMSO 組比較，PC12 細胞經(jīng)H2O2作用，細胞內(nèi)的LDH 釋放量增加。但當(dāng)高劑量二甲雙胍與H2O2聯(lián)合作用后，細胞內(nèi)的LDH 釋放量降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組PC12 細胞LDH 釋放量比較（±s）

表4 各組PC12 細胞LDH 釋放量比較（±s）

注：DMSO 組為DMSO 處理；H2O2 組為H2O2 處理；二甲雙胍高劑量+H2O2 組為2mmol/L 二甲雙胍+H2O2 處理；DMSO 為二甲基亞砜；與DMSO 組比較，aP＜0.05；與H2O2 組比較，bP＜0.05

3.4 二甲雙胍降低H2O2誘導(dǎo)的細胞凋亡 與DMSO 組比較，PC12 細胞經(jīng)H2O2作用，細胞凋亡率增加。但當(dāng)二甲雙胍與H2O2聯(lián)合作用后，細胞凋亡率降低（P＜0.05）。見表5，圖1。

圖1 二甲雙胍降低H2O2 誘導(dǎo)的細胞凋亡（×200）

表5 各組PC12 細胞凋亡率比較（%，±s）

表5 各組PC12 細胞凋亡率比較（%，±s）

注：DMSO 組為DMSO 處理；H2O2 組為H2O2 處理；二甲雙胍高劑量+H2O2 組為2mmol/L 二甲雙胍+H2O2 處理；DMSO 為二甲基亞砜；與DMSO 組比較，aP＜0.05；與H2O2 組比較，bP＜0.05

3.5 二甲雙胍降低H2O2導(dǎo)致的ROS 水平 與DMSO 組比較，PC12 細胞經(jīng)H2O2作用，細胞ROS 水平升高（P＜0.05）。但當(dāng)二甲雙胍與H2O2聯(lián)合作用后，細胞ROS 水平降低（P＜0.05）。見表6。

表6 各組PC12 細胞ROS 含量比較（%，±s）

表6 各組PC12 細胞ROS 含量比較（%，±s）

注：DMSO 組為DMSO 處理；H2O2 組為H2O2 處理；二甲雙胍高劑量+H2O2 組為2mmol/L 二甲雙胍+H2O2 處理；DMSO 為二甲基亞砜；與DMSO 組比較，aP＜0.05；與H2O2 組比較，bP＜0.05

3.6 二甲雙胍激活Nrf2/HO-1 信號通路 與DMSO組比較，二甲雙胍能夠濃度依賴性地提高Nrf2 和HO-1 mRNA 水平（P＜0.05）。Western blot 結(jié)果顯示，二甲雙胍能夠濃度依賴性地提高Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平（P＜0.05）。見表7-8，圖2。

圖2 二甲雙胍提高Nrf2 和HO-1 蛋白表達

表7 各組Nrf2 和HO-1 mRNA 相對表達量比較（±s）

表7 各組Nrf2 和HO-1 mRNA 相對表達量比較（±s）

注：DMSO 組為DMSO 處理；H2O2 組為H2O2 處理；二甲雙胍低劑量組為0.5mmol/L 二甲雙胍處理；二甲雙胍中劑量組為1mmol/L 二甲雙胍處理；二甲雙胍高劑量組為2mmol/L 二甲雙胍處理；DMSO 為二甲基亞砜；與DMSO 組比較，aP＜0.05

3.7 二甲雙胍通過Nrf2 的激活起到保護作用DMSO 組細胞活力（100.00±0.00）；H2O2組細胞活力（62.33±3.21）；二甲雙胍高劑量+H2O2組細胞活力（78.02±7.63）；二甲雙胍高劑量+H2O2+siNrf2 組細胞活力（59.77±2.25）。與二甲雙胍高劑量+H2O2組比較，沉默Nrf2 后細胞存活率降低（P＜0.05）。

表8 各組Nrf2 和HO-1 蛋白相對表達量比較（±s）

表8 各組Nrf2 和HO-1 蛋白相對表達量比較（±s）

注：DMSO 組為DMSO 處理；H2O2 組為H2O2 處理；二甲雙胍低劑量組為0.5mmol/L 二甲雙胍處理；二甲雙胍中劑量組為1mmol/L 二甲雙胍處理；二甲雙胍高劑量組為2mmol/L 二甲雙胍處理；DMSO 為二甲基亞砜；與DMSO 組比較，aP＜0.05

4 討論

缺血性腦卒中是因腦動脈血栓梗塞而造成的一種高致死率、高致殘率的腦血管疾病，溶栓是缺血性腦卒中的重要治療手段[1]。然而，溶栓后的CIRI 會加重疾病進展的可能。研究發(fā)現(xiàn)，CIRI 的發(fā)生涉及多個病理機制，如氧化應(yīng)激損傷、炎癥因子損傷、鈣超載等，其中氧化應(yīng)激是其最為核心的致病機制[6-8]。在CIRI 的病理過程中，氧化應(yīng)激會產(chǎn)生大量的ROS，破壞細胞的正常功能，降低多種氧化酶的活性，造成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 等的損傷，最終誘導(dǎo)腦細胞凋亡甚至腦組織壞死[8]。因此，使用抗氧化劑清除ROS 是治療CIRI 的一種重要手段。

研究表明，抗氧化劑能夠通過激活抗氧化信號通路，上調(diào)抗氧化蛋白表達來清除ROS。其中Nrf2/ARE 是重要的抗氧化信號通路之一，抗氧化劑刺激后，Nrf2 與胞漿蛋白伴侶分子Keap1 解耦聯(lián)合后進入細胞核，與抗氧化反應(yīng)元件ARE 結(jié)合，啟動HO-1等蛋白表達間接清除ROS[9]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)不同濃度的二甲雙胍（0.5、1 和2mmol/L）作用PC12 細胞后，其對PC12 細胞未表現(xiàn)毒害作用，低中濃度下對PC12 細胞的細胞活力具有輕微的促進作用。因此，本研究選用該三組藥物濃度進行后續(xù)的研究。研究表明，H2O2通過增加ROS 的產(chǎn)生而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，因此我們建立H2O2誘導(dǎo)PC12 細胞損傷模型研究二甲雙胍的抗氧化作用。我們發(fā)現(xiàn)相對于DMSO 組，H2O2處理組的細胞生存率明顯降低，當(dāng)二甲雙胍和H2O2共同作用下，細胞生存率呈濃度依賴性提高。研究發(fā)現(xiàn)，H2O2能夠誘導(dǎo)細胞凋亡，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激相關(guān)酶LDH 釋放[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2O2處理PC12 細胞后，細胞的凋亡率提高，但二甲雙胍處理后能夠降低細胞凋亡率。二甲雙胍濃度依賴性地降低LDH 的釋放，同時，二甲雙胍能夠降低PC12 細胞內(nèi)ROS 水平，說明二甲雙胍通過降低ROS 水平抑制細胞凋亡和減少LDH 釋放起到細胞保護作用。研究結(jié)果表明，二甲雙胍夠濃度依賴性地提高Nrf2 和HO-1 mRNA 和蛋白水平，沉默Nrf2 后，二甲雙胍可降低H2O2誘導(dǎo)的細胞損傷，提示二甲雙胍可能通過激活Nrf2/HO-1 通路起到細胞保護作用。

綜上所述，二甲雙胍可能是一個Nrf2 誘導(dǎo)劑，其通過激活Nrf2/HO-1 通路對H2O2誘導(dǎo)的PC12 細胞損傷起到保護作用。