陳芳萍，王琪，鄭丹，官志忠，樓迪棟，4

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)教研室，貴陽 550004；2.貴陽市婦幼保健院圍產(chǎn)期保健科，貴陽 550003；3.貴州醫(yī)科大學(xué)地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室，貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室，貴陽 550004；4.貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，貴陽 550025）

甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）俗稱“冰毒”，能夠引起強烈的精神興奮，是一種極易成癮的新型合成毒品［1］。研究證實，METH作用于多個存在獎勵機制的大腦區(qū)域（邊緣系統(tǒng)、海馬體、伏隔核），主要通過促進單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及抑制其再攝取導(dǎo)致成癮［2］。長期吸食METH可導(dǎo)致意識障礙、幻聽、幻視、抑郁等臨床癥狀，顯示了METH的神經(jīng)毒性作用［3-5］。METH誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性主要表現(xiàn)為多種神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞炎癥、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。METH精神依賴性強、藥效持久且價格相對低廉，因此成為世界范圍內(nèi)的主要毒品之一。而METH長期濫用導(dǎo)致的神經(jīng)毒性及成癮性給公共健康帶來沉重負(fù)擔(dān)［6-7］。

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是一種ω-3不飽和脂肪酸，俗稱“腦黃金”，是生物膜中磷脂的重要成分，對人類神經(jīng)細(xì)胞的生長及功能維持起著重要作用。DHA在機體內(nèi)代謝可衍生成炎癥抑制介質(zhì)消退素和保護素。消退素和保護素調(diào)控各種黏附分子和炎癥介質(zhì)的表達和釋放，不僅具有強效的抗炎促消退效應(yīng)，還具有神經(jīng)保護作用［8］。本研究主要采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究并鑒定人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y 細(xì)胞蛋白表達和相關(guān)信號通路的變化，探討DHA在METH誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中的作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

SH-SY5Y 細(xì)胞株購自美國Sigma 公司。主要試劑包括METH（美國 Cerilliant 公司，標(biāo)準(zhǔn)品：M-009，純度99.9 %）、DHA（美國Sigma 公司）、DMEM∶F12 細(xì)胞培養(yǎng)基（美國 Gibco 公司）、annexin V-FITC 雙染凋亡試劑盒（江蘇凱基生物公司）。主要儀器包括流式細(xì)胞儀（美國 Beckman 公司）、LC-20AB液相系統(tǒng)（日本 Shimadzu公司）、UltiMate 3000液相色譜儀、Q-Exactive HF X串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 ：配制含 89 % DMEM∶F12、10 % 胎牛血清、1 % 雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)液，1～2 d換液 1 次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行傳代。根據(jù)前期實驗［9］結(jié)果，設(shè)置METH的作用濃度為2.0 mmol·L-1，作用時間為24 h，將同時段培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y 細(xì)胞分為METH（2.0 mmol·L-1）組、METH（2.0 mmol·L-1）+DHA（50 μmol·L-1）組、Control組（不含METH與DHA）［10-11］。用相應(yīng)的含METH和DHA的培養(yǎng)基處理各組細(xì)胞，37 ℃、5 % CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 Tandem Mass Tags（TMT）標(biāo)記定量蛋白組學(xué)：收集每個樣本中的細(xì)胞液，加入終濃度10 mmol·L-1的二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），利用超聲儀破碎裂解，4 ℃ 25 000g離心15 min，取上清。上清中加入終濃度55 mmol·L-1的碘代乙酰胺（iodoacetamide，IAA），暗室放置45 min。4 ℃ 25 000g離心15 min，取上清得到蛋白液。將蛋白溶液加入Trypsin酶，渦旋振蕩后，低速離心1 min，37 ℃孵育2 h。

將酶切并除鹽后的肽段與TMT溶液（0.8 mg）快速混合均勻，震蕩離心，室溫放置2 h；使用LC-20AB液相系統(tǒng)，對樣品進行液相分離。經(jīng)過液相分離的肽段通過nanoESI源離子化后進入串聯(lián)質(zhì)譜儀Q-Exactive HF X進行Data-dependent Acquisition（DDA）模式檢測。

1.2.3 生物信息學(xué)分析：在Mascot Percolator算法的基礎(chǔ)上對標(biāo)記的多肽與同位素標(biāo)簽進行定量分析，使FDR≤0.01。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用STRING（https：//string-db.org）進行分析，置信度為0.7。

1.2.4 形態(tài)學(xué)觀察與細(xì)胞長短軸比值計算：顯微鏡下觀察SH-SY5Y的形態(tài)，記錄各組圖像；測量各組細(xì)胞的長軸與短軸，計算比值［12］。

1.2.5 SH-SY5Y細(xì)胞凋亡水平檢測：用不含乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化培養(yǎng)板中的細(xì)胞 1 min，溫和吹打并收集，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate-buffered saline，PBS）漂洗 3 次后懸浮于結(jié)合緩沖液中，加入 annexin V-FITC/PI 雙染料，避光染色 15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DHA可改善METH引起的SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

結(jié)果顯示，Control組SH-SY5Y細(xì)胞呈長梭形，具有較長的神經(jīng)突。METH組SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)突縮短，胞體萎縮，呈圓形；METH+DHA組SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)突皺縮情況有所改善，見圖1。不同組SH-SY5Y細(xì)胞長軸與短軸比值的分析結(jié)果顯示，METH組（1.48±0.09）較對照組（3.16±0.17）減小（P＜0.05），METH+DHA組（2.09±0.13）較METH組增大（P＜0.05）。

圖1 各組SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較 ×200Fig.1 Comparison of the morphology of SH-SY5Y cells in each group ×200

2.2 DHA緩解METH誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組［Q2：（0.91±0.23）%；Q3：（3.09±0.32）%］比較，METH組［Q2：（3.24±0.27）%；Q3：（5.72±0.74）%］早期凋亡細(xì)胞（Q3）和晚期凋亡細(xì)胞（Q2）比例升高，且總凋亡細(xì)胞（Q2+Q3）與對照組［（4.01±0.53）% ］比較，METH組［（8.96±0.60）%］比例也明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與METH組比較，METH+DHA組晚期凋亡細(xì)胞［（1.53±0.20）%］和總凋亡細(xì)胞 ［（5.63±0.51）%］細(xì)胞比例降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而早期凋亡細(xì)胞［（4.10±0.52）%］比例改變沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但仍表現(xiàn)出了降低的趨勢，見圖2?？梢奙ETH具有神經(jīng)毒性作用，同時也表明DHA對經(jīng)METH處理的SH-SY5Y細(xì)胞具有神經(jīng)保護作用。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析SH-SY5Y細(xì)胞凋亡Fig.2 Analysis of apoptosis in SH-SY5Y cells by flow cytometry

2.3 差異表達蛋白（differentially expressed proteins，DEPs）分析

定量質(zhì)譜共檢測到的767 173個肽段，以1%為標(biāo)準(zhǔn)的肽段匹配率（peptide-spectrum matches，PSM）和假陽性率（false discovery rate，F(xiàn)DR）判斷，共識別出6 543個蛋白。以倍數(shù)變化＞1.200視為上調(diào)蛋白，倍數(shù)變化＜0.833視為下調(diào)蛋白。與對照組比較，METH組蛋白譜發(fā)生了顯著變化，上調(diào)蛋白1 249個（19.09%），下調(diào)蛋 白1 503個（22.97%）。在METH+DHA組和對照組的比較中，共識別出2 754個DEPs，其中1 243個上調(diào)，1 511個下調(diào)。在METH+DHA組和METH組的比較中，共識別出70個DEPs，其中36個上調(diào)，34個下調(diào)，見圖3。

圖3 Control組、METH組和METH+DHA組的蛋白全譜比較Fig.3 Comparison of the protein profiles in the Control，METH，and METH+DHA groups

2.4 DHA反向調(diào)節(jié)METH誘導(dǎo)的DEPs（圖4）

圖4 DEPs的聯(lián)合分析Fig.4 Combination analysis for DEPs

為進一步了解DHA對METH神經(jīng)毒性的緩解作用，在METH組與對照組相比得到的DEPs和METH+DHA組與METH組相比得到的DEPs基礎(chǔ)上，篩選出兩者間調(diào)控相反的DEPs。如圖4所示，有7個蛋白既在METH組與對照組比較中上調(diào)，又在METH+DHA組與METH組比較中下調(diào)；METH組與對照組比較中15個下調(diào)蛋白在METH+DHA組與METH組中重新上調(diào)。提示此22個反向調(diào)節(jié)的蛋白可能與DHA緩解METH神經(jīng)毒性有關(guān)。對此22個反向調(diào)節(jié)蛋白進行相互作用的網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，11個蛋白存在相互作用，其作用分別涉及細(xì)胞骨架、核糖體以及谷胱甘肽代謝，見圖5。

圖5 反向調(diào)節(jié)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig.5 Interaction network of the reversely regulated proteins

3 討論

本研究從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞凋亡的角度揭示了DHA可緩解METH引起的神經(jīng)毒性，并運用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了METH引起的SH-SY5Y蛋白全譜的變化，揭示了DHA在METH神經(jīng)毒性作用方面的潛在有效靶點。

研究［13-15］發(fā)現(xiàn)METH可誘導(dǎo)神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞的骨架重排，可能誘發(fā)神經(jīng)結(jié)構(gòu)的改變和血腦屏障的破壞。此外，在METH的誘導(dǎo)下，大鼠C6星形膠質(zhì)細(xì)胞也呈現(xiàn)為圓形。本研究結(jié)果顯示，加入METH后，鏡下可見SH-SY5Y細(xì)胞質(zhì)突起明顯縮短，趨向于圓形，提示METH可引起神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)變化，與以往研究［16］結(jié)果一致。另一方面已有研究顯示，反復(fù)暴露于METH可導(dǎo)致紋狀體多巴胺能軸突末梢發(fā)生神經(jīng)退行性病變［17］。在METH作用下小膠質(zhì)細(xì)胞也經(jīng)歷由C/EBP-β活化誘導(dǎo)的凋亡過程［18-19］。本研究中流式細(xì)胞術(shù)顯示了METH顯著增加了早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞比例，說明了其誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的神經(jīng)毒性作用。

DHA是大腦中主要的ω-3多不飽和脂肪酸，由于其獨特的神經(jīng)保護和抗炎特性而備受關(guān)注。研究［20］表明，DHA可增加靶標(biāo)微管蛋白的表達，而微管蛋白是細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)單位。本研究觀察到DHA增加了SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)突的長度，同時使6種角蛋白的表達重新上調(diào)。角蛋白作為保持細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定的基本單位，可能是DHA緩解METH神經(jīng)毒性的作用靶標(biāo)。谷胱甘肽通過其還原性巰基具有抗氧化和解毒作用。研究［21］表明，DHA增加總谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）活性，對于H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、凋亡具有保護作用。GPX蛋白家族，尤其是GPX1和GPX4，主要功能是清除H2O2和減少過氧化物的生成，對神經(jīng)元的活性和功能至關(guān)重要［22-23］。本研究結(jié)果顯示METH降低了SH-SY5Y細(xì)胞中GPX4的表達，加入DHA可以顯著回調(diào)其表達，并緩解神經(jīng)細(xì)胞凋亡，表明DHA可能通過調(diào)節(jié)GPX4，進一步改善谷胱甘肽代謝，進而緩解METH引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，DHA可以緩解METH引起的SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)及功能的改變，其機制可能與調(diào)控角蛋白和GPX4等信號通路密切相關(guān)。本研究為戒毒治療藥物研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。然而定量蛋白組學(xué)只能宏觀檢測蛋白質(zhì)量的變化，并不能反應(yīng)出具體功能的改變，因此，DHA減弱METH誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用的具體機制仍需進一步闡明。