徐海琪，黃心悅，張麗君

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，沈陽 110001）

含有E3泛素蛋白連接酶2的WW結(jié)構(gòu)域（recombinant WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2，WWP2）是編碼Nedd4家族成員中一種重要的E3連接酶［1-3］。WWP2參與包括膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)降解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及轉(zhuǎn)錄凋亡等多種細(xì)胞過程，并與腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［4］。急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是血液系統(tǒng)的一種異質(zhì)性惡性腫瘤，預(yù)后較差，其病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。本研究擬觀察WWP2對(duì)ALL細(xì)胞系生物學(xué)行為的可能的影響，旨在探討該基因?qū)LL發(fā)生發(fā)展的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料

ALL細(xì)胞系Jurkat來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液研究室。RPMI-1640及PBS購自美國Gibco公司；polybrene、兩性霉素B及嘌呤霉素購自日本Sigma公司；Higene購自中國普利萊公司；質(zhì)粒購自中國吉?jiǎng)P公司；多柔比星（doxorubicin，dox）購自美國輝瑞制藥有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)公司；細(xì)胞凋亡試劑盒及組織活性氧購自中國碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃孵箱中培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞。細(xì)胞傳代3次后行臺(tái)盼藍(lán)染色，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞，存活率≥97%即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用PBS清洗細(xì)胞，接種至6孔板中（密度60%～70%），更換含polybrene（6 μg/mL）的培養(yǎng)基。分別加入60 μL含WWP2shRNA及空載的病毒液孵育，48 h后再滴加60 μL，48 h后更換培養(yǎng)瓶，補(bǔ)5～10 mL培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞生長情況。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，向培養(yǎng)基中加入10 μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行陽性篩選。將1 mL 0.9% NaCl、24 μL轉(zhuǎn)染試劑、HA質(zhì)粒15 μL、WWP2質(zhì)粒20 μL混勻后，室溫靜置20 min，加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，36～48 h后觀察細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后Jurkat細(xì)胞（3.0×105/mL）接種于96孔板中，100 μL/孔。設(shè)置空白孔，設(shè)置不同濃度（0、0.05、0.1、0.2、0.4 μmol/mL）dox藥物處理組，每組4個(gè)復(fù)孔，孵育6 h，加入CCK-8試劑10 μL/孔，繼續(xù)孵育1 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品450 nm處OD值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)：將經(jīng)過0.2 μmol/mL dox處理的細(xì)胞重懸于500 μL binding buffer中，分別加入細(xì)胞3 μL FITC和1 μL PI染料，混勻，同時(shí)設(shè)置3管FITC-/PI-、FITC+/PI-、FITC-/PI+，避光靜置10～15 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 活性氧檢測(cè)：用無血清RPMI-1640稀釋（1∶1 000）活性氧熒光探針（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）至終濃度10 μmol/L。收集細(xì)胞，與DCFH-DA充分接觸，于37 ℃孵育30 min，每隔3～5 min顛倒混勻1次，用RPMI-1640洗滌細(xì)胞3次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。利用甩片機(jī)將細(xì)胞甩至載玻片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0和Graphpad prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用秩和檢驗(yàn)的非參數(shù)檢驗(yàn)方式分析，兩變量相關(guān)程度采用雙變量相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WWP2表達(dá)水平與細(xì)胞增殖活性

分別用0、0.05、0.1、0.2、0.4 μmol/mL的dox刺激細(xì)胞48 h，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)探討WWP2對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果表明，與未敲減的對(duì)照組相比，敲減WWP2后，細(xì)胞增殖活性明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而過表達(dá)WWP2后，細(xì)胞增殖活性則明顯升高（P＜0.01），見圖1。當(dāng)dox濃度為0.2 μmol/mL時(shí)，細(xì)胞增殖活性約為50%，因此選擇該藥物濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度dox刺激下各組細(xì)胞增殖能力的比較Fig.1 Comparison of cells proliferation under different concentrations of dox between different groups

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，加入dox后，敲減WWP2組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯增高（P＜0.01），而過表達(dá)WWP2基因組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯降低（P＜0.01），見圖2。提示W(wǎng)WP2基因可能作為癌基因抑制Jurkat細(xì)胞的凋亡。未經(jīng)dox處理的各組細(xì)胞凋亡率無顯著差異，WWP2低表達(dá)的細(xì)胞對(duì)dox更敏感，而WWP2表達(dá)水平較高的細(xì)胞對(duì)dox不敏感，因此，推測(cè)dox對(duì)細(xì)胞的損傷作用可能部分受WWP2基因調(diào)控。

圖2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組Jurkat細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis analysis of Jurkat cells by flow cytometry

2.3 細(xì)胞中活性氧檢測(cè)結(jié)果

熒光顯微鏡下可見，與對(duì)照組相比，加入0.2 μmol/mL dox后，敲減WWP2組細(xì)胞更亮，細(xì)胞數(shù)相對(duì)更少（圖3A），而過表達(dá)WWP2組細(xì)胞更暗，細(xì)胞數(shù)相對(duì)更多（圖3B）。間接證明，敲減WWP2的Jurkat細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)增多，而過表達(dá)WWP2的Jurkat細(xì)胞產(chǎn)生活性氧物質(zhì)減少；dox對(duì)敲減WWP2的Jurkat細(xì)胞抑制作用明顯增強(qiáng)，對(duì)過表達(dá)WWP2的細(xì)胞抑制作用則減弱。

3 討論

WWP2基因位于染色體16q21.1，可在人類心臟、腦、肝臟、胰腺、肺及腎臟等器官表達(dá)。WWP2參與多種細(xì)胞過程，并與腫瘤相關(guān)底物結(jié)合，與腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［4］。FUKUMOTO等［5］發(fā)現(xiàn)，在人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中WWP2mRNA表達(dá)上調(diào)，蛋白表達(dá)顯著增加；敲除WWP2基因可抑制細(xì)胞增殖能力，但對(duì)遷移能力則無顯著影響。研究［6-10］表明，WWP2在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)水平上調(diào)，發(fā)揮癌基因的作用。有學(xué)者研究了WWP2與淋巴瘤的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該基因可作為生物標(biāo)志物鑒別反應(yīng)性濾泡增生和濾泡性淋巴瘤。文獻(xiàn)［11-12］報(bào)道，日本蟾蜍毒治療對(duì)多發(fā)性骨髓瘤誘導(dǎo)的骨溶解具有抑制作用。

ALL是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，以未成熟的淋巴樣細(xì)胞分化和增殖受損為主，發(fā)生于骨髓、外周血或某些髓外組織中［13］。ALL多發(fā)病于2～5歲或50歲后［14］。近年來，兒童ALL治愈率明顯提高，而成人ALL預(yù)后遠(yuǎn)不如小兒［15］，長期無病生存率僅為35%～45%［16-17］。ALL預(yù)后較差，治愈率僅為20%～40%［18］。WWP2在多種實(shí)體腫瘤中均發(fā)揮癌基因的作用［7-10］，而它在血液系統(tǒng)，尤其是ALL中的作用機(jī)制尚未明確。本研究首次探討了WWP2在ALL中的作用，通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)以及活性氧染色等方法觀察了WWP2基因?qū)LL細(xì)胞系Jurkat的生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示，敲減WWP2基因使Jurkat細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞凋亡增多，產(chǎn)生活性氧減少，而過表達(dá)WWP2產(chǎn)生的作用則相反。本研究還發(fā)現(xiàn)，WWP2基因敲減的細(xì)胞對(duì)dox更加敏感，而WWP2過表達(dá)的細(xì)胞對(duì)dox的敏感性則明顯降低。這意味著對(duì)WWP2低表達(dá)的患者應(yīng)用dox藥物治療可能產(chǎn)生良好的效果，但WWP2高表達(dá)的患者則應(yīng)考慮選擇其他合適的藥物進(jìn)行治療。因此，臨床上可以對(duì)所有ALL初治患者進(jìn)行WWP2表達(dá)水平檢測(cè)，其結(jié)果將會(huì)為ALL疾病的治療及預(yù)后提供依據(jù)。另外，WWP2也許可作為指導(dǎo)ALL患者的治療及預(yù)后的靶基因，為相關(guān)靶向藥物研究及復(fù)發(fā)難治患者的治療提供新的思路。

綜上所述，本研究首次證明了WWP2基因可能是ALL新的潛在癌基因，有望為疾病診斷、治療和預(yù)測(cè)預(yù)后提供新的靶點(diǎn)。此外，對(duì)WWP2低表達(dá)的患者，dox是一種很有效的藥物，而對(duì)WWP2高表達(dá)的患者應(yīng)慎重選擇其他合適的化療藥物。