李潤洲，周欣

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，致死率居?jì)D科惡性腫瘤首位［1-2］。卵巢癌患者早期無明顯癥狀，約3/4的卵巢癌患者首次確診即為晚期，預(yù)后不良［3］。因此，深入研究卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上尋找卵巢癌相關(guān)的分子標(biāo)志物，對(duì)提高卵巢癌的診治水平及改善患者的預(yù)后具有重要意義。

ACAP1（ADP-ribosylation factor GTPase-activating proteins with coiled-coil，ankyrin repeat and PH domains 1）是ACAP家族成員之一，屬于GTP酶激活蛋白（GTPase-activating proteins，GAPs），可調(diào)節(jié)GTP結(jié)合蛋白ADP核糖基化因子-6（ADP-ribosylation factor 6，ARF6）的功能。ARF6在內(nèi)吞、分泌、吞噬、細(xì)胞黏附和遷移中起調(diào)節(jié)作用［4-8］。ACAP1是ARF6特異性的GAP，可以與ARF6共同參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。ACAP1還能調(diào)節(jié)整合素內(nèi)循環(huán)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移［9-14］。研究［15］表明，泛素特異性蛋白酶6（ubiquitin-specific protease 6，USP6）表達(dá)下調(diào)可能通過影響ARF6/ACAP1依賴的途徑抑制細(xì)胞增殖和胞質(zhì)分裂。ACAP1可能與多種疾病相關(guān)［16-23］，但它與卵巢惡性腫瘤關(guān)系的研究較少。因此，本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測ACAP1在卵巢漿液性囊腺癌組織及正常卵巢組織中的表達(dá)情況，分析其與卵巢癌患者臨床病理因素之間的關(guān)聯(lián)，并初步探討ACAP1在卵巢惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

通過Oncomine網(wǎng)站（http：//www.oncomine.org）分析ACAP1mRNA水平與卵巢癌的相關(guān)性［24］；通過cBioportal網(wǎng)站（http：//www.cbioportal.org）分析卵巢癌中ACAP1基因突變的類型［25］；通過GeneMANIA網(wǎng)站（http：//www.genemania.org）分析ACAP1相關(guān)信號(hào)通路以及相互作用蛋白［26］。

1.2 免疫組化染色

收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院2012年9月至2015年9月手術(shù)切除且病理診斷為卵巢漿液性囊腺癌的癌組織88例，其中，配對(duì)卵巢癌原發(fā)及轉(zhuǎn)移灶組織67例，因良性病變切除的卵巢組織16例。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未經(jīng)任何治療；術(shù)后病理確診為卵巢漿液性囊腺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前經(jīng)過放化療或靶向治療；轉(zhuǎn)移性卵巢癌；有其他腫瘤病史。本研究獲得中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

主要試劑包括抗ACAP1多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），兔SP試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。取標(biāo)本蠟塊制5 μm厚連續(xù)切片，應(yīng)用EliVision 二步法進(jìn)行免疫組化染色，依次行烤片、二甲苯脫臘、梯度乙醇水化、抗原修復(fù)、PBS緩沖液沖洗、抗體孵育、DAB顯色、流水沖洗和蘇木素復(fù)染等步驟，最終以中性樹膠封片。根據(jù)著色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行半定量評(píng)分。光鏡下每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野。先根據(jù)著色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。再根據(jù)陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：陽性細(xì)胞百分比≤25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。2項(xiàng)評(píng)分相乘，每張切片所有視野評(píng)分取平均值，1～2分為（-），3～4分為（+），5～8分為（++），9～12分為（+++）。將5～12分定義為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用t檢驗(yàn)比較ACAP1表達(dá)的組間差異。采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行ACAP1表達(dá)水平與臨床病理因素間的關(guān)系分析。采用Kaplan-Meier分析探討ACAP1在卵巢癌原發(fā)灶中的表達(dá)水平與總生存期的關(guān)系。采用Cox 回歸對(duì)影響卵巢癌預(yù)后的臨床病理因素進(jìn)行單因素及多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACAP1 mRNA在不同癌癥中的表達(dá)水平

應(yīng)用Oncomine 網(wǎng)站分析ACAPsmRNA在不同癌癥中的表達(dá)情況（圖1，表1），比較卵巢癌中的7個(gè)數(shù)據(jù)集［27-32］，其中2個(gè)數(shù)據(jù)集結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ADIB 等［27］比較16例卵巢漿液性囊腺癌與4例卵巢癌組織，發(fā)現(xiàn)ACAP1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達(dá)上調(diào)（P=0.019，fold change=1.389）。BONOME等［30］比較185例卵巢癌組織與10例卵巢組織，發(fā)現(xiàn)ACAP1在卵巢癌組織中表達(dá)上調(diào)（P=1.9e-4，fold change=1.268）。

表1 ACAP1 在卵巢癌組織中的表達(dá)情況Tab.1 The expression of ACAP1 in ovarian cancer

圖1 ACAPs mRNA在不同癌癥中的表達(dá)情況Fig.1 Expression levels of ACAPs mRNA in various cancers

2.2 ACAPs在卵巢癌中的基因變異

應(yīng)用cBioportal網(wǎng)站檢測4個(gè)ACAP家族成員，發(fā)現(xiàn)存在不同程度的基因變異，ACAP1、ACAP2、ACAP3、ACAP4均存在基因的重復(fù)及缺失，ACAPs總變異率為29.85%，其中最多的基因變異為重復(fù)，變異率為28.13%（數(shù)據(jù)集：TCGA，F(xiàn)irehose Legacy）。見圖2。

圖2 ACAPs的基因變異率分析Fig.2 The analyses of genetic variations of ACAPs

2.3 ACAP家族基因互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。

應(yīng)用GeneMANIA 網(wǎng)站繪制ACAP家族基因相互作用圖，同時(shí)分析互作蛋白的功能，見圖3。與ACAP家族關(guān)系最密切的5個(gè)基因是GULP1（engulfment adaptor PTB domain containing 1）、ARF6、RAB11FIP3（RAB11 family interacting protein 3）、SLC2A4（solute carrier family 2 member 4）、VAMP3（vesicle associated membrane protein 3）。GULP1與ACAP1及ARF6存在通路上的聯(lián)系。ARF6與ACAP1、ACAP2存在通路關(guān)系，與ACAP4存在物理互作。這些互作蛋白主要參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)及胞內(nèi)體回收等功能。

圖3 ACAPs 基因互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig.3 The gene-gene interaction network of ACAPs

2.4 ACAP1在卵巢漿液性囊腺癌組織和正常卵巢組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果表明，ACAP1 蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，它在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達(dá)水平（5.4±1.9）高于正常卵巢組織（3.3±1.1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖4、圖5。

圖4 ACAP1在正常卵巢組織、卵巢癌原發(fā)灶及卵巢癌轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)情況Fig.4 The expression of ACAP1 in normal ovarian tissues，primary ovarian carcinoma and metastatic lesion of ovarian cancer

圖5 ACAP1在正常卵巢組織與卵巢癌組織中的表達(dá)情況Fig.5 The expression of ACAP1 in normal ovarian tissues and ovarian carcinoma

2.5 ACAP1在卵巢癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理因素的關(guān)系

根據(jù)免疫組化結(jié)果評(píng)分，將88例卵巢癌分為ACAP1低表達(dá)組（-/+）及ACAP1高表達(dá)組（++/+++），應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，在年齡、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移、腹水量等方面，ACAP1高表達(dá)組與低表達(dá)組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 ACAP1表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系Tab.2 Relationships between ACAP1 expression in ovarian serous carcinoma and clinicopathological factors

2.6 ACAP1在原發(fā)灶中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

本研究對(duì)88例卵巢漿液性癌患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間截止至2020年4月30日，實(shí)際隨訪85例，失訪3例，隨訪率為97%。應(yīng)用IBM SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，ACAP1在卵巢癌原發(fā)灶中的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)（P=0.037）。見圖6。

圖6 ACAP1在卵巢漿液性囊腺癌原發(fā)灶中的表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系Fig.6 Correlations of ACAP1 expression with the prognosis of patients with serous ovarian carcinoma

2.7 ACAP1在卵巢漿液性囊腺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，ACAP1在卵巢癌轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)水平（7.7±2.0）明顯高于原發(fā)灶（5.5±1.8），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.8 卵巢漿液性囊腺癌預(yù)后相關(guān)因素分析

以隨訪死亡或隨訪結(jié)束為觀察終點(diǎn)，計(jì)算患者總生存期（overall survival OS），應(yīng)用Cox回歸模型進(jìn)行卵巢癌預(yù)后相關(guān)因素的單因素及多因素分析。單因素分析結(jié)果提示，ACAP1的表達(dá)（P=0.041）、腹水量（P=0.003）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.001）、FIGO分期（P=0.001）與患者OS顯著相關(guān)。多因素分析結(jié)果提示，F(xiàn)IGO分期（P=0.031）是影響卵巢漿液性囊腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表3。

表3 卵巢癌預(yù)后的單因素及多因素分析Tab.3 Univariate and multivariate Cox regression analysis of the OS of patients with serous ovarian carcinoma

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，致死率居女性生殖系統(tǒng)腫瘤之首［1］。大多數(shù)卵巢癌患者一經(jīng)確診即為晚期，晚期（Ⅲ～Ⅳ期）患者5年生存率僅為30%～40%，而早期（Ⅰ～Ⅱ期）患者5年生存率可達(dá)70%［33-34］。因此，深入研究卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的診治靶點(diǎn)，對(duì)改善卵巢癌患者預(yù)后具有重要意義。本研究通過生物信息學(xué)分析及免疫組化實(shí)驗(yàn)，探討了ACAP1在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，并對(duì)其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

免疫組化結(jié)果顯示，ACAP1在卵巢漿液性囊腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常卵巢組織，提示ACAP1過表達(dá)可能與卵巢癌的發(fā)生有關(guān)。有研究［15］表明，敲除ACAP1可抑制細(xì)胞增殖及胞質(zhì)分裂，提示ACAP1可能參與胞質(zhì)分裂過程，結(jié)合本研究結(jié)果，提示ACAP1過表達(dá)可能通過促進(jìn)胞質(zhì)分裂過程而促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生。ACAP1是ARF6的特異性GAP［35］，2007年MA等［7］在細(xì)胞水平驗(yàn)證了ACAP1過表達(dá)可以降低ARF6-GTP的水平，而過表達(dá)GULP1可部分抑制ACAP1的這種作用。本研究通過GeneMANIA 網(wǎng)站構(gòu)建ACAP1蛋白互作圖，結(jié)果提示，ACAP1與GULP1存在信號(hào)通路及物理互作關(guān)系，提示ACAP1可能通過GULP1-ACAP1-ARF6通路促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生。

本研究還發(fā)現(xiàn)，ACAP1在卵巢癌轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)水平高于卵巢癌原發(fā)灶，提示ACAP1可能參與卵巢癌的腹腔轉(zhuǎn)移進(jìn)程。有研究［9-10］通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明敲除ACAP1可抑制細(xì)胞遷移，ACAP1被Akt磷酸化后可影響β1整合素內(nèi)循環(huán)，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移，提示ACAP1可能通過促進(jìn)細(xì)胞遷移而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展。腫瘤細(xì)胞的免疫浸潤及腫瘤微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［36-37］。2020年ZHANG等［20］應(yīng)用多個(gè)生物信息學(xué)網(wǎng)站分析ACAP1與卵巢癌腫瘤免疫浸潤的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACAP1與TILs正相關(guān)，ACAP1的表達(dá)與多種免疫抑制因子、免疫激活因子、趨化因子相關(guān)；通過GSEA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)ACAP1與免疫檢查點(diǎn)相關(guān)；通過Kaplan-Meier plotter 網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，ACAP1高表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后不良有關(guān)。該研究認(rèn)為，ACAP1與卵巢癌細(xì)胞的免疫浸潤及腫瘤微環(huán)境相關(guān)。還有研究［19］發(fā)現(xiàn)，ACAP1可能是決定膀胱尿路上皮癌免疫浸潤水平的候選基因。以上均表明ACAP1可能與腫瘤細(xì)胞的免疫浸潤及腫瘤微環(huán)境相關(guān)，ACAP1可能通過相似的機(jī)制促進(jìn)卵巢癌的腹腔轉(zhuǎn)移。

本研究中，對(duì)88例卵巢癌患者進(jìn)行術(shù)后隨訪，以探討ACAP1在卵巢癌原發(fā)灶中的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，ACAP1在卵巢癌原發(fā)灶中的高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，但ACAP1的表達(dá)與患者的年齡、腫瘤分期、CA125水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移情況及腹膜轉(zhuǎn)移情況無明確相關(guān)性。提示ACAP1有可能是影響卵巢癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但多因素分析結(jié)果未能證實(shí)此結(jié)論，這可能與研究樣本數(shù)量偏小有關(guān)，今后有必要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行分析。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)ACAP1蛋白在卵巢漿液性囊腺癌組織中呈高表達(dá)，在卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)高于原發(fā)灶，原發(fā)灶中ACAP1高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)，提示ACAP1可能參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，并可能成為卵巢癌診治的潛在靶點(diǎn)。生物信息學(xué)分析結(jié)果提示，ACAP1可能通過GULP1-ACAP1-ARF6通路促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生。