劉楓，張韓，李彥明，魯雪麗

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院a.重癥醫(yī)學(xué)科；b.心血管內(nèi)科，河南 開封 475000)

膿毒癥是由于微循環(huán)障礙、細(xì)胞凋亡等多種原因引起的全身多個器官功能異常的疾病，凝血異常、心血管反應(yīng)失調(diào)、內(nèi)皮功能障礙是膿毒癥的常見特征，心臟是膿毒癥最常見的受損器官之一，約有50%的膿毒癥患者伴有心肌損傷[1]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是常見的體外誘導(dǎo)膿毒癥心肌細(xì)胞損傷的因子，心肌細(xì)胞分泌炎癥因子和過度凋亡是膿毒癥心肌損傷發(fā)生的關(guān)鍵機制[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度超過200個核糖核苷酸的長鏈非編碼RNA，通過RNA的形式調(diào)控多個生理活動，如細(xì)胞凋亡、新陳代謝、血管再生、心臟老化、胚胎發(fā)育等[3]。很多研究已報道，lncRNA與缺氧復(fù)氧心肌損傷、膿毒癥心肌損傷、糖尿病心肌病等心臟疾病有關(guān)[4]。以前的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SLC8A1-AS1在心肌梗死中表達(dá)下調(diào)，而上調(diào)SLC8A1-AS1可改善心臟功能，減少炎癥因子分泌，縮小心肌梗死面積，SLC8A1-AS1可能是心肌損傷的保護因子[5]?，F(xiàn)階段對SLC8A1-AS1在膿毒癥心肌細(xì)胞損傷中的作用還不清楚。本研究首先檢測了膿毒癥大鼠心肌組織中SLC8A1-AS1的表達(dá)，并以LPS誘導(dǎo)構(gòu)建體外膿毒癥心肌細(xì)胞模型，探討SLC8A1-AS1對膿毒癥心肌細(xì)胞炎癥因子分泌的影響，為靶向分子治療膿毒癥心肌損傷提供方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料清潔級SD大鼠購自鄭州大學(xué)動物實驗中心，體質(zhì)量180～200 g，雌雄各半。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(豫)2018-001，動物使用許可證號：SYXK(豫)2018-005，動物質(zhì)量合格證號：0050472。大鼠心肌H9C2細(xì)胞購自深圳市拓普生物科技有限公司；TNF-α含量檢測試劑盒購自深圳市科潤達(dá)生物工程有限公司；IL-6含量檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa；IL-1β含量檢測試劑盒購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；p65抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology。陰性對照表達(dá)載體(pcDNA)、SLC8A1-AS1過表達(dá)載體(pcDNA-SLC8A1-AS1)均由武漢金開瑞生物工程有限公司構(gòu)建。本實驗符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)河南大學(xué)淮河醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查通過。

1.2 膿毒癥心肌損傷大鼠模型構(gòu)建Model組大鼠按照下述方法構(gòu)建[6]：用100 g·L-1的水合氯醛麻醉大鼠，將大鼠仰臥置于操作臺上，消毒，于大鼠的前腹部中線進行3 cm剖腹手術(shù)，將腹腔打開，分離盲腸，以3.0無菌絲線結(jié)扎盲腸，并用16號針頭將結(jié)扎位置對穿2次，擠壓盲腸，觀察穿孔位置出現(xiàn)少量糞便時，將盲腸返回，縫合，關(guān)腹，將切口消毒。Normal組大鼠不做穿刺，其余同Model組。最后每組大鼠剩余9只。各組大鼠在造模后24 h再次以水合氯醛麻醉，處死，打開胸腔，留取心肌組織，用于1.3中檢測。

1.3 qRT-PCR方法檢測膿毒癥大鼠心肌組織中SLC8A1-AS1表達(dá)采用Trizol提取心肌組織中的總RNA，以RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得第1條cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系如下：1 μL總RNA、1 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser、6 μL RNase free ddH2O，42 ℃孵育2 min。在上述體系中加4 μL 5×PrimerScript Buffer、1 μL RT Primer mix、1 μL PrimerScript RT Enzyme mixI、10 μL Reaction mix before，最后加RNase free ddH2O至20 μL，37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s，置于4 ℃保存。取cDNA，配制如下體系：2 μL上游和下游引物、5 μL cDNA模板、0.4 μL DYE Ⅱ、10 μL 2×SYBR RT-PCR mix，最后加ddH2O至20 μL。置于PCR儀中，設(shè)置程序為：95 ℃ 30 s(預(yù)變性)，95 ℃ 5 s(變性)，60 ℃退火延伸，循環(huán)40次。結(jié)果以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為參照，以2-△△Ct法計算SLC8A1-AS1的表達(dá)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組將心肌H9C2細(xì)胞分成以下幾組。(1)Control組：正常培養(yǎng)。(2)LPS組：實驗0 h時用10 mg·L-1的LPS處理培養(yǎng)。(3)Vector+LPS組：實驗前12 h，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染陰性對照表達(dá)載體；實驗0 h時，用10 mg·L-1的LPS處理培養(yǎng)。(4)SLC8A1-AS1+LPS組：實驗前12 h，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SLC8A1-AS1過表達(dá)載體；實驗0 h時，用10 mg·L-1的LPS處理培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。取培養(yǎng)12 h后的Control、LPS、Vector+LPS、SLC8A1-AS1+LPS組細(xì)胞，按照1.3中qRT-PCR方法檢測SLC8A1-AS1的表達(dá)。

1.5 ELISA法檢測細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α水平收集培養(yǎng)12 h后的Control、LPS、Vector+LPS、SLC8A1-AS1+LPS組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，分別用ELISA法檢測培養(yǎng)液上清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量，按照檢測試劑盒的說明書進行檢測。

1.6 NF-κB信號激活劑PMA對SLC8A1-AS1影響心肌細(xì)胞的作用檢測取轉(zhuǎn)染SLC8A1-AS1過表達(dá)載體以后的心肌細(xì)胞，用10 mg·L-1的LPS和1 μmol·L-1的NF-κB信號激活劑PMA處理培養(yǎng)，記為SLC8A1-AS1+LPS+PMA組，以SLC8A1-AS1+LPS組為參照，用ELISA法檢測細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

2 結(jié)果

2.1 SLC8A1-AS1在膿毒癥大鼠心肌組織中表達(dá)下調(diào)Model組大鼠心肌組織中SLC8A1-AS1表達(dá)低于Normal組(P<0.05)。SLC8A1-AS1在膿毒癥大鼠心肌組織中表達(dá)下調(diào)。見表1。

表1 膿毒癥大鼠心肌組織中 SLC8A1-AS1表達(dá)變化

2.2 SLC8A1-AS1過表達(dá)載體上調(diào)膿毒癥心肌細(xì)胞模型中SLC8A1-AS1表達(dá)與Control組比較，LPS組心肌細(xì)胞中SLC8A1-AS1表達(dá)降低(P<0.05)。與Vector+LPS組比較，SLC8A1-AS1+LPS組心肌細(xì)胞中SLC8A1-AS1表達(dá)升高(P<0.05)。見表2。

表2 SLC8A1-AS1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后膿毒癥心肌細(xì)胞模型中SLC8A1-AS1表達(dá)

2.3 上調(diào)SLC8A1-AS1對膿毒癥心肌細(xì)胞模型炎癥因子分泌的影響與Control組比較，LPS組心肌細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α增多(P<0.05)。與Vector+LPS組比較，SLC8A1-AS1+LPS組心肌細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α減少(P<0.05)。見表3。

表3 上調(diào)SLC8A1-AS1后膿毒癥心肌細(xì)胞模型分泌IL-1β、IL-6、TNF-α水平

2.4 上調(diào)SLC8A1-AS1對膿毒癥心肌細(xì)胞模型NF-κB信號的影響與Control組比較，LPS組心肌細(xì)胞中p65蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與Vector+LPS組比較，SLC8A1-AS1+LPS組心肌細(xì)胞中p65蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖1和表4。

圖1 Western blot方法檢測上調(diào)SLC8A1-AS1對膿毒癥心肌細(xì)胞模型中p65蛋白表達(dá)的影響

表4 上調(diào)SLC8A1-AS1后膿毒癥心肌細(xì)胞模型中p65蛋白水平

2.5 NF-κB信號激活劑對上調(diào)SLC8A1-AS1影響膿毒癥心肌細(xì)胞炎癥因子分泌的作用與SLC8A1-AS1+LPS組比較，SLC8A1-AS1+LPS+PMA組分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)。見表5。

表5 NF-κB信號激活劑對上調(diào)SLC8A1-AS1影響膿毒癥心肌細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α水平

3 討論

非編碼RNA是近些年來生命科學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點，包含lncRNA、miRNA、環(huán)狀RNA等，其中l(wèi)ncRNA是指長度超過200個核糖核苷酸的非編碼RNA，lncRNA在人體組織的各個器官中表達(dá)，并且參與多個生理活動，lncRNA與細(xì)胞生長、染色質(zhì)印記、細(xì)胞凋亡、炎癥等有關(guān)[7]。很多研究已經(jīng)證實，lncRNA調(diào)控人類疾病進展，并且lncRNA有望成為疾病治療的分子靶點[8]。心肌損傷是造成心臟功能異常的關(guān)鍵，其受到lncRNA的調(diào)控[9]。有研究顯示，SLC8A1-AS1在心肌梗死動物模型中下調(diào)，而上調(diào)SLC8A1-AS1能夠減輕心肌損傷，縮小梗死面積，抑制炎癥[5]。本研究結(jié)果顯示，SLC8A1-AS1在膿毒癥大鼠心肌組織中下調(diào)。

膿毒癥是一種全身系統(tǒng)疾病，病死率和發(fā)病率極高，心功能不全、心肌抑制等是膿毒癥患者常見的并發(fā)癥，心肌損傷也是誘導(dǎo)多個器官衰竭的關(guān)鍵因素[10]。研究顯示，膿毒癥心肌細(xì)胞釋放大量的炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α，這些炎癥因子可以加重炎癥反應(yīng)，促進炎癥損傷，另一方面還可以激活細(xì)胞凋亡，促進心肌細(xì)胞損傷[11]。本研究表明，LPS誘導(dǎo)的體外膿毒癥心肌細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α增多，而上調(diào)SLC8A1-AS1能夠減弱LPS對心肌細(xì)胞的上述作用，這說明SLC8A1-AS1具有抑制體外膿毒癥炎癥因子釋放的作用。

lncRNA發(fā)揮作用的機制較為復(fù)雜，目前尚未完全闡明，其可以通過作用于下游基因或信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)揮多重生物學(xué)功能[12]。NF-κB作用復(fù)雜，具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，在哺乳動物體內(nèi)廣泛存在，參與免疫反應(yīng)、腫瘤生長、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多個過程[13]。NF-κB家族龐大，其中p65是NF-κB信號發(fā)揮作用的關(guān)鍵亞單位[14]。研究報道，NF-κB過度激活加重心肌細(xì)胞損傷，而抑制NF-κB信號能夠減弱心肌損傷[15]。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)SLC8A1-AS1能夠降低體外膿毒癥心肌細(xì)胞模型中p65蛋白表達(dá)，而NF-κB信號激活劑逆轉(zhuǎn)了上調(diào)SLC8A1-AS1對體外膿毒癥心肌細(xì)胞炎癥因子釋放的作用，上調(diào)SLC8A1-AS1通過NF-κB信號發(fā)揮作用。

綜上，SLC8A1-AS1在膿毒癥心肌細(xì)胞損傷中可能發(fā)揮保護作用，上調(diào)SLC8A1-AS1抑制體外膿毒癥心肌細(xì)胞炎癥因子釋放，這與下調(diào)NF-κB信號有關(guān)。目前尚未分析SLC8A1-AS1通過何種靶向機制影響NF-κB信號發(fā)揮作用，在以后研究中會對這部分內(nèi)容進行探討。本研究為靶向基因治療膿毒癥心肌損傷提供了思路，為研究SLC8A1-AS1在心臟疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)。