時(shí) 潔，劉 偉，周 蓮，劉衛(wèi)紅，耿曉康

(1.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院西醫(yī)部藥劑科，湖北 恩施 445000；2.華潤(rùn)武鋼總醫(yī)院放射科，湖北 武漢 430080；3.恩施州中心醫(yī)院婦兒醫(yī)院藥劑科，湖北 恩施 445000)

百草枯(1,1’-二甲基-4,4’-聯(lián)吡啶二氯化物)是一種非選擇性接觸性除草劑，對(duì)人類有劇毒，中毒后死亡率極高。肺是百草枯中毒的主要靶器官，肺損傷引起的呼吸衰竭是最常見(jiàn)的死亡原因[1]?；颊咄瑫r(shí)出現(xiàn)肺泡破裂導(dǎo)致的肺氣腫和纖維化導(dǎo)致的肺不張，而使用呼吸機(jī)會(huì)加重病情[2]。

細(xì)胞外基質(zhì)的組成和力學(xué)性質(zhì)在肺纖維化的發(fā)展過(guò)程中發(fā)生了顯著改變，可誘導(dǎo)肺纖維化和肺不張[3]。肺纖維化和肺不張可能是百草枯中毒后機(jī)體維持肺泡結(jié)構(gòu)完整的機(jī)制之一。當(dāng)前并沒(méi)有針對(duì)百草枯中毒的特效藥，只能做一些血液凈化和對(duì)癥治療[4]。主流的抗炎和抗氧化藥物對(duì)百草枯中毒療效有限[5]，因此，尋找百草枯中毒的新機(jī)制是其治療的突破口。有研究認(rèn)為，百草枯中毒會(huì)導(dǎo)致肺泡細(xì)胞的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化樣細(xì)胞反應(yīng)，以避免細(xì)胞死亡[6]。此外，百草枯中毒還可導(dǎo)致緊密連接的關(guān)鍵蛋白ZO-1等丟失[7]。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一類主要的細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，百草枯中毒后，MMP也被誘導(dǎo)表達(dá)[8]。肺泡細(xì)胞的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的激活、ZO-1等丟失和MMP的誘導(dǎo)可能與炎癥相互促進(jìn)[9]，共同導(dǎo)致了肺泡結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。抑制這種細(xì)胞外基質(zhì)不穩(wěn)定性的改變，抑制炎癥，打破相互促進(jìn)的循環(huán)，可能有利于百草枯中毒的治療。阿托伐他汀具有抑制MMP活性，改善百草枯所致肺損傷的作用[8]。免疫抑制劑環(huán)孢素A通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和MMP，可減輕移植中的氣道重塑和纖維化[9]，也能抑制百草枯導(dǎo)致的肺纖維化[10]。本研究通過(guò)探索阿托伐他汀聯(lián)合環(huán)孢素A對(duì)百草枯中毒大鼠細(xì)胞外基質(zhì)改變和炎癥及肺纖維化的療效，以期為臨床治療百草枯中毒提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

20%百草枯溶液(批號(hào)：SNA8F03206)購(gòu)自江蘇南通的先正達(dá)南通農(nóng)作物保護(hù)有限公司；阿托伐他汀(批號(hào)：H20133127，樂(lè)普醫(yī)藥)；環(huán)孢素A(批號(hào)：H10960122，中美華東制藥)；羥脯氨酸含量檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：AKAM017C，北京盒子生工)；Masson’s染色試劑盒(批號(hào)：1.00485，Sigma，美國(guó))；蘇木精/伊紅(HE，批號(hào)：C0105S)、TNF-α(批號(hào)：PT516)、IL-1β(批號(hào)：PI303)、IL-6(批號(hào)：PI328)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒、SOD(批號(hào)：S0086)、MDA(批號(hào)：S0131S)、GSH試劑盒(批號(hào)：S0073)、RIPA裂解液(批號(hào)：P0013C)、BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào)：P0012)均購(gòu)自上海碧云天；TGF-β(批號(hào)：3709)、Collagen Ⅰ(批號(hào)：91144)、E-cadherin(批號(hào)：14472)、Vimentin(批號(hào)：5741)、α-SMA(批號(hào)：19245)、β-actin(批號(hào)：4970)和山羊抗兔(批號(hào)：7074)均購(gòu)自美國(guó)CST;MMP-9(批號(hào)：ab228402)、MMP-2(批號(hào)：ab92536)、Collagen Ⅲ(批號(hào)：ab6310)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

Wistar大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g，6周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。每籠3只喂養(yǎng)于SPF動(dòng)物房，環(huán)境條件：22 ℃，光照12 h/黑暗12 h，常規(guī)飲食，自由攝食和飲水，實(shí)驗(yàn)前習(xí)慣1周。隨機(jī)分為對(duì)照(Control)組、模型(PQ)組、阿托伐他汀(PQ+STN)組、環(huán)孢素A(PQ+CsA)組、聯(lián)合用藥(PQ+STN+CsA)組，每組10只。Control組給予生理鹽水1 mL灌胃，其余4組單次給予單劑量百草枯20 mg/kg灌胃以染毒。然后，PQ組以生理鹽水1 mL灌胃，PQ+STN組、PQ+CsA組以及PQ+STN+CsA組分別以阿托伐他汀20 mg/kg[11]、環(huán)孢素A 10 mg/kg[12]以及阿托伐他汀20 mg/kg+環(huán)孢素A 10 mg/kg灌胃，每天1次。給藥7 d后，腹膜內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉600 μL，麻醉后立即處死。收集心內(nèi)血液約4 mL，以5 000 r/min離心5 min后將血清儲(chǔ)存于-70 ℃。將每只大鼠的左肺放在冷凍的移液管中，于-70 ℃下保存，用以檢測(cè)組織蛋白表達(dá)。

1.3 肺濕重/干重比、羥脯氨酸含量測(cè)定及組織染色

濾紙充分吸干右上肺水分，測(cè)量濕重，充分干燥后測(cè)量干重，計(jì)算濕重/干重比。右后肺葉剪去部分組織調(diào)整重量至大致相等，剪碎，加6 mol/L鹽酸(1 g組織：100 mL鹽酸)，120 ℃孵育12 h，濾掉雜質(zhì)。取1 mL濾液，氫氧化鈉調(diào)整pH值于6.5～7.0，加1 mL氯胺酮溶液(50 mmol/L)室溫孵育20 min，1 mL二甲基苯甲醛溶液(200 mL/L)60 ℃孵育20 min，采用多功能酶標(biāo)儀(型號(hào)Varioskan LUX，賽默飛，上海)測(cè)量550 nm處吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品羥脯氨酸含量。

將大鼠右副肺葉浸入10%的多聚甲醛緩沖液中固定后包埋在石蠟中。隨后將肺葉分離并矢狀切成5 μm厚的切片，進(jìn)行HE和Masson’s染色。通過(guò)光學(xué)顯微鏡檢查切片，并評(píng)估肺組織損傷和纖維化。染色的每個(gè)樣本至少觀察來(lái)自不同部位的6片。

1.4 ELISA檢測(cè)肺組織IL-1β、TNF-α和IL-6含量

肺組織在液氮研磨，加少許生理鹽水獲得勻漿，10 000 r/min離心15 min，取上清，用BCA試劑盒測(cè)量蛋白濃度并配平。使用ELISA試劑盒按說(shuō)明書測(cè)定肺組織中的IL-1β、TNF-α和IL-6含量。

1.5 Western blot檢測(cè)TGF-β、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin和α-SMA等細(xì)胞移動(dòng)能力相關(guān)蛋白的表達(dá)

肺組織加入RIPA裂解液在冰上研磨，10 000 r/min離心15 min，取上清。BCA試劑盒測(cè)量蛋白濃度并配平，加入上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min。在10% SDS-PAGE膠上按一般要求電泳后，轉(zhuǎn)移至甲醇浸沒(méi)過(guò)的PVDF膜。用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h，一抗孵育過(guò)夜，二抗孵育1 h，前后均用TBST清洗3次。膜上滴加ECL顯色液，在高靈敏發(fā)光成像儀中拍照。條帶用Image J半定量。

1.6 肺組織SOD、MDA和還原型GSH測(cè)定

取1.5所得平衡后的溶液，根據(jù)說(shuō)明書測(cè)定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

定量和半定量數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.0軟件統(tǒng)計(jì)并作圖。數(shù)據(jù)均采取雙側(cè)單因素方差分析(ANOVA)和Tukey’s多重比較分析差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況

PQ組大鼠百草枯染毒后次日開(kāi)始出現(xiàn)嗜睡，進(jìn)食飲水減少，呼吸急促，口周、鼠尾及腳趾發(fā)紺，呼吸困難等癥狀；其他組大鼠在百草枯染毒3 d后開(kāi)始出現(xiàn)以上癥狀，但相對(duì)較輕。未發(fā)現(xiàn)死亡及其他不適。

2.2 肺組織損傷和纖維化

HE染色結(jié)果顯示，與Control組比較，PQ組肺泡壁變厚、免疫細(xì)胞聚集、肺泡破裂；Masson’s染色顯示肺組織明顯纖維化。與PQ組比較，PQ+STN組、PQ+CsA組和PQ+STN+CsA組均可一定程度抑制百草枯導(dǎo)致的肺泡壁變厚、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡破裂等肺損傷的表現(xiàn)(圖1a)，減輕肺纖維化(圖1b)，其中PQ+STN+CsA組與PQ組的差異最顯著。與Control組比較，PQ組肺濕重/干重比升高(P<0.05)、肺羥脯氨酸含量增加(P<0.01)。與PQ組比較，PQ+STN組、PQ+CsA組和PQ+STN+CsA組大鼠肺濕重/干重比及肺羥脯氨酸含量均降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1c、d。說(shuō)明阿托伐他汀和環(huán)孢素A能減輕百草枯染毒大鼠的肺纖維化，且兩藥共用效果更佳。

a：肺組織HE染色(×40)；b：肺組織Masson’s染色(×400)；c：右上肺濕重/干重比；d：右后肺葉羥脯氨酸含量 *：與Control組比較，P<0.05，#：與Control組比較，P<0.01；△：與PQ組比較，P<0.05；▲：與PQ組比較，P<0.01

2.3 肺部炎癥因子

與Control組比較，PQ組TNF-α、IL-1β和IL-6升高(P<0.01)。與PQ組比較，PQ+STN組、PQ+CsA組和PQ+STN+CsA組均能降低百草枯誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。說(shuō)明阿托伐他汀和環(huán)孢素A均能減輕百草枯誘導(dǎo)的肺部炎癥。

a：肺組織TNF-α表達(dá)量；b：肺組織IL-1β表達(dá)量；c：肺組織IL-6表達(dá)量 #：與Control組比較，P<0.01；△：與PQ組比較，P<0.05；▲：與PQ組比較，P<0.01

2.4 肺氧化應(yīng)激反應(yīng)

與Control組比較，PQ組MDA增加(P<0.01)，SOD和GSH降低(P<0.01)。與PQ組比較，PQ+STN組、PQ+CsA組和PQ+STN+CsA組均能增加百草枯誘導(dǎo)的SOD和GSH，降低MDA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。說(shuō)明阿托伐他汀和環(huán)孢素A均能減輕百草枯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

a：肺組織SOD含量；b：肺組織MDA含量；c：肺組織GSH含量 #：與Control組比較，P<0.01；△：與PQ組比較，P<0.05；▲：與PQ組比較，P<0.01

2.5 肺纖維化標(biāo)志物

與Control組比較，PQ組TGF-β、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ升高(P<0.01)。與PQ組比較，PQ+STN組、PQ+CsA組和PQ+STN+CsA組均能降低百草枯誘導(dǎo)的TGF-β、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。表明阿托伐他汀和環(huán)孢素A可抑制百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化。

a：Western blot檢測(cè)3種蛋白的表達(dá)；b：TGF-β相對(duì)表達(dá)量；c：Collagen Ⅰ相對(duì)表達(dá)量；d：Collagen Ⅲ相對(duì)表達(dá)量 #：與Control組比較，P<0.01；△：與PQ組比較，P<0.05；▲：與PQ組比較，P<0.01

2.6 肺細(xì)胞移動(dòng)性標(biāo)志蛋白表達(dá)

與Control組比較，PQ組MMP-2、MMP-9、Vimentin和α-SMA升高(P<0.01)，E-cadherin降低(P<0.01)。與PQ組比較，PQ+STN組、PQ+CsA組和PQ+STN+CsA組MMP-2和MMP-9表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5a～c。與PQ組比較，PQ+STN組、PQ+CsA組和PQ+STN+CsA組不同程度抑制Vimentin和α-SMA表達(dá)，激活E-cadherin表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5a、d～f。表明聯(lián)合用藥能有效抑制細(xì)胞移動(dòng)性標(biāo)志蛋白的高表達(dá)。

a：細(xì)胞移動(dòng)性相關(guān)蛋白的表達(dá)；b：MMP-2相對(duì)表達(dá)量；c：MMP-9相對(duì)表達(dá)量；d：Vimentin相對(duì)表達(dá)量；e：E-cadherin相對(duì)表達(dá)量；f：α-SMA相對(duì)表達(dá)量 #：與Control組比較，P<0.01；△：與PQ組比較，P<0.05；▲：與PQ組比較，P<0.01

3 討論

肺纖維化導(dǎo)致肺不張和呼吸衰竭是百草枯中毒患者最致命的病理狀況[13]，而當(dāng)前尚無(wú)有效應(yīng)對(duì)措施，病情稍重患者病死率接近100%[2]。在以往的研究中，阿托伐他汀和環(huán)孢素A等藥物均表現(xiàn)出對(duì)百草枯中毒患者肺纖維化的防治作用[11-12]。阿托伐他汀與環(huán)孢素A均可不同程度減輕百草枯誘導(dǎo)的肺組織損傷和纖維化，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低纖維化與細(xì)胞移動(dòng)性標(biāo)志蛋白的表達(dá)，且阿托伐他汀聯(lián)合環(huán)孢素A具有更好的療效。本研究聯(lián)用阿托伐他汀與環(huán)孢素A，嘗試抑制細(xì)胞外基質(zhì)不穩(wěn)定性的改變及炎癥，以打破炎癥與細(xì)胞外基質(zhì)不穩(wěn)定性的相互促進(jìn)，治療百草枯中毒大鼠。

當(dāng)前認(rèn)為百草枯的毒理機(jī)制主要是誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)(reactive oxygen specie，ROS)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4,14]。百草枯與肺泡細(xì)胞吸收的天然多胺具有結(jié)構(gòu)相似性，因此百草枯會(huì)濃縮在I型和Ⅱ型肺泡細(xì)胞中，導(dǎo)致肺中百草枯的濃度比血漿中高10～20倍，引起氧化還原循環(huán)并產(chǎn)生大量的活性氧[3]。一些能夠降低ROS的療法往往也能延緩病程。如在大鼠中，阿司匹林可以改善線粒體動(dòng)力學(xué)，減少ROS生成，進(jìn)而降低百草枯的毒性[15]。而在臨床上，自由基清除藥物依達(dá)拉奉雖然能有效延緩病程，但是并不能改變疾病轉(zhuǎn)歸[3]，可見(jiàn)單純的抗氧化難以發(fā)揮足夠的療效。本研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀和環(huán)孢素A均能降低MDA，升高SOD和GSH，提示其能一定程度抑制ROS產(chǎn)生，且二者共同作用后效果更明顯?？紤]到阿托伐他汀和環(huán)孢素A并不具有直接的抗氧化能力，其抑制ROS的效果可能是通過(guò)對(duì)病程的抑制間接產(chǎn)生的。

ROS導(dǎo)致炎癥反應(yīng)并與其相互促進(jìn)，進(jìn)而加重病情[4]。百草枯能激活炎性免疫細(xì)胞，分泌炎癥因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，增加細(xì)胞外基質(zhì)的不穩(wěn)定性。因此免疫缺陷的大鼠百草枯中毒的癥狀相對(duì)較輕[16]。對(duì)于百草枯中毒所致炎癥，免疫抑制可能是較好抗炎的選擇[17]。環(huán)孢素A是一種較為常用的免疫抑制劑，以往研究顯示其能抑制百草枯中毒導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)[10]。本研究結(jié)果也表明環(huán)孢素A可以抑制百草枯導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，同時(shí)阿托伐他汀也能一定程度抑制百草枯誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)，二者共用效果更明顯。

百草枯中毒后，會(huì)誘導(dǎo)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化樣細(xì)胞反應(yīng)，從而阻止肺上皮細(xì)胞凋亡[6]，此外，百草枯中毒還會(huì)導(dǎo)致緊密連接破壞[7]，MMP表達(dá)增加[8]。分析其原因可能是細(xì)胞移動(dòng)性增加，導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而致。肺纖維化可能是這種細(xì)胞外基質(zhì)改變?cè)斐傻姆闻萜屏褍A向的某種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制導(dǎo)致。一方面，TGF-β常鑲嵌于細(xì)胞外基質(zhì)，在細(xì)胞外基質(zhì)受損時(shí)釋放，激活炎癥，是誘導(dǎo)肺纖維化的重要調(diào)節(jié)蛋白[5]；Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ往往存在于皮膚等組織中，在肺組織中較少。纖維化發(fā)生時(shí)，肺部Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ會(huì)異常沉積[18]，TGF-β、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ在肺中的表達(dá)提示肺細(xì)胞外基質(zhì)改變。百草枯升高了TGF-β、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表達(dá)，而阿托伐他汀聯(lián)合環(huán)孢素A能有效降低其表達(dá)。另一方面，MMP-2和MMP-9是調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)降解以及細(xì)胞移動(dòng)性的關(guān)鍵酶，二者可被多種百草枯中毒的解救藥物抑制[8]。本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可抑制MMP-2和MMP-9，使細(xì)胞外基質(zhì)更為穩(wěn)定，能降低肺泡破裂的可能性，減弱纖維化相關(guān)病理進(jìn)程；炎癥的過(guò)度激活本身也會(huì)導(dǎo)致MMP激活及細(xì)胞外基質(zhì)降解，導(dǎo)致肺纖維化，這可能是脂多糖之類的致炎因子誘導(dǎo)肺纖維化的機(jī)制[19]。抑制MMP也能減少炎癥的過(guò)度激活，進(jìn)而延緩病情。上述研究與本研究共同表明，抑制肺泡破裂傾向進(jìn)而抑制纖維化，可能是阿托伐他汀聯(lián)合環(huán)孢素A發(fā)揮藥效的關(guān)鍵機(jī)制。

綜上，阿托伐他汀聯(lián)合環(huán)孢素A可從多角度降低百草枯中毒所致肺纖維化程度，其作用機(jī)制包括抑制炎癥、氧化應(yīng)激和降低細(xì)胞移動(dòng)性。本研究的不足之處在于，環(huán)孢素A是典型的肝藥酶抑制劑，會(huì)延長(zhǎng)阿托伐他汀體內(nèi)清除的周期[20]，因此，阿托伐他汀的劑量難于把握，本研究?jī)H僅給出一個(gè)免疫抑制劑和他汀類聯(lián)用可能更有利于治療肺纖維化的提示，具體何種藥物組合以及劑量效果更佳更安全，有待大量研究進(jìn)一步證實(shí)。