亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        過表達miR-449a對潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜的保護作用及機制研究

        2021-10-28 13:23:32李建紅
        局解手術學雜志 2021年10期
        關鍵詞:潰瘍性緩沖液結腸炎

        盧 靜,李建紅,彭 巍

        (1.成都市第五人民醫(yī)院神經內科,四川 成都 611130;2.成都市第五人民醫(yī)院普外科,四川 成都 611130)

        1 材料與方法

        1.1 材料

        研究對象:SD健康雄性大鼠(由江蘇大學動物實驗中心提供)40只,體質量210~230 g,平均(219.00±19.95)g,放在溫度18~26 ℃、濕度45%~55%的干凈籠子中喂養(yǎng),飲水和新鮮干燥的飼料均進行消毒之后供其自由食用1周。

        主要試劑:兔抗小鼠免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)抗體(BD公司);兔抗大鼠白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)、白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)抗體(Dako公司);大鼠鼠抗兔緊密連接蛋白Claudin-1、Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)抗體(Hyclone公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 建模及分組 隨機選取10只大鼠作為對照組,不做任何處理。其余30只大鼠進行潰瘍性結腸炎建模,造模前所有大鼠禁食不禁水36 h,稱重后使用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔內注射麻醉,灌胃針用潤滑油涂抹后,從大鼠肛門口插入約8 cm左右,將1 mL混合液一次性注入,再注入0.5 mL空氣,捏緊肛門,將大鼠臀部傾斜朝上約15 min,使其自然蘇醒,注意保暖。大鼠出現(xiàn)濃血便、體型消瘦、少食懶動、瞇眼、反應遲鈍等生理表現(xiàn)時表明建模成功。最終25只大鼠建模成功,將其隨機分為模型組9只,抑制miR-449a組8只,過表達miR-449a組8只。將所有大鼠放置于玻璃麻醉箱內麻醉,將含4%七氟醚棉球的小燒杯(50 mL)放入麻醉箱內,待動物出現(xiàn)呼吸變慢、四肢緊張度明顯降低、角膜反射遲鈍、皮膚痛覺消失等表現(xiàn),則表明大鼠進入到麻醉期。麻醉之后抑制miR-449a組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg antagomiR-449a進行干預,過表達miR-449a組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg agomiR-449a進行干預,對照組及模型組大鼠尾部靜脈注射等量生理鹽水。

        1.2.2 標本采集 藥物干預24 h后,取各組大鼠尾部靜脈血2 mL,2 000 r/min離心15 min后分離上清液,置于-80 ℃保存待檢。

        1.2.3 HE染色 對各組大鼠進行全身麻醉處理后,采用斷頭法分批處死所有大鼠,獲取腸黏膜組織,液氮冷凍后常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋,間距5 mm作連續(xù)切片。將切片按順序置入不同濃度酒精中。使用蘇木精染色15 min后清洗3次,使用鹽酸酒精分化處理30 s,清洗之后使用1%伊紅染色,封片后使用顯微鏡進行觀察。

        1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測炎癥因子相關指標 取血清5 mL,離心處理后于-80 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法對IL-8、IL-10、IL-17、TNF-α表達量進行檢測。使用包被緩沖液將特異性抗體球蛋白稀釋至最為合適的濃度(1~10 μg/mL);隨后在每個凹孔內增加0.3 mL,放置在0 ℃保存過夜;次日移去包被緩沖液之后使用洗滌緩沖液每5 min對凹孔進行沖洗,共沖洗3次,在每個凹孔內加入0.2 mL含抗原的標本,在37 ℃下作用2 h,隨后使用洗滌緩沖液(含0.05%吐溫-20)洗滌3次。加入0.2 mL抗體溶液(稀釋緩沖液稀釋過后的酶標記特異性抗體溶液)在37 ℃下作用2 h。PBS溶液重復洗滌3次。洗滌后在每個凹孔內加入0.2 mL底物溶液,于常溫下作用30 min后在每個凹孔內加入2 mol/L H2SO4或者2 mol/L檸檬酸0.05 mL,使用酶標比色儀對IL-8、IL-17、IL-10、TNF-α水平進行評價。

        1.2.5 免疫透射比濁法檢測免疫球蛋白及環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)水平 準備3根試管并分別標記為標準管、測定管及空白管,均加入350 μL緩沖液,標準管中加入20 μL IgA、IgM、IgG、COX-2標準液,測定管中加入20 μL血清,空白管中加入20 μL蒸餾水,分別搖勻,常溫靜置5~10 min后使用分光光度計進行比色,在500 nm波長處以空白管調零,記錄吸光度,計算IgA、IgM、IgG、COX-2水平。

        1.2.6 免疫組織化學染色法檢測Claudin-1、TLR4表達 對標本進行脫蠟、水化等處理之后,將其浸泡于0.01 mol/L、95 ℃的枸櫞酸緩沖液中,并進行熱修復,3% H2O2環(huán)境下培育10 min,滴入山羊血清,26 ℃環(huán)境中培養(yǎng)30 min,抽離封閉液,添加Claudin-1、TLR4一抗,將其置于5 ℃過夜培養(yǎng),次日加入二抗,于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)30 min,清洗后進行DAB顯色、封片。

        5)提高全社會水資源保護意識。拓寬公眾參與和輿論監(jiān)督渠道,充分利用媒體媒介的作用,加強水法、水資源保護條例、水污染防治法等法律法規(guī)的宣傳力度,調動公眾參與水資源保護的積極性和自覺性,鼓勵舉報違法排污行為,嚴厲查處污染和破壞水資源的不法行為。

        1.2.7 Western blot法檢測細胞凋亡相關蛋白表達水平 取大鼠腸黏膜組織,加入裂解液裂解、勻漿、提取總蛋白,與緩沖液混合100 ℃煮沸5 min后電泳(120 V,3 h)。在90 V、4 ℃下將靶蛋白轉移至NC膜上,轉膜時間為90 min,5%脫脂牛奶封閉2 h,加入一抗(1∶300),過夜孵育。加入二抗(1∶5 000)孵育2 h,顯影、定影、沖洗、晾干,掃描膠片,采用Image J軟件分析細胞凋亡相關蛋白p-p38、過氧化酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARγ)、核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)表達,以β-actin為內參,目標蛋白水平=目標條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

        1.3 統(tǒng)計學分析

        2 結果

        2.1 各組大鼠結腸組織病理情況

        如圖1所示,對照組大鼠結腸黏膜上皮完整,杯狀細胞隱窩較為完整。模型組大鼠結腸黏膜杯狀細胞減少,損傷面積較大,隱窩變形,有炎性細胞浸潤。抑制miR-449a組大鼠結腸黏膜杯狀細胞減少,隱窩有一定的變形,炎性細胞浸潤。過表達miR-449a組大鼠結腸黏膜未見明顯的糜爛、損傷,炎性細胞浸潤有所減少。

        2.2 各組大鼠IL-8、IL-10、IL-17水平比較

        與對照組相比,模型組、抑制miR-449a組大鼠IL-8、IL-17較高,IL-10較低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組相比,抑制miR-449a組、過表達miR-449a組大鼠IL-8、IL-17較低,IL-10較高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與抑制miR-449a組相比,過表達miR-449a組大鼠IL-8、IL-17較低,IL-10較高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖2。

        a:與對照組比較,P<0.05;b:與模型組比較,P<0.05;c:與抑制miR-449a組比較,P<0.05

        2.3 各組小鼠免疫球蛋白水平比較

        與對照組相比,模型組大鼠IgA、IgM、IgG均有所上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組相比,抑制miR-449a組大鼠IgA、IgM、IgG均有所上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與抑制miR-449a組相比,過表達miR-449a組大鼠IgA、IgM、IgG均有所下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3。

        a:與對照組比較,P<0.05;b:與模型組比較,P<0.05;c:與抑制miR-449a組比較,P<0.05

        2.4 各組大鼠TNF-α、COX-2水平比較

        與對照組相比,模型組大鼠TNF-α、COX-2有所上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組相比,抑制miR-449a組大鼠TNF-α、COX-2有所下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與抑制miR-449a組相比,過表達miR-449a組大鼠TNF-α、COX-2有所下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖4。

        a:與對照組比較,P<0.05;b:與模型組比較,P<0.05;c:與抑制miR-449a組比較,P<0.05

        2.5 各組大鼠Claudin-1、TLR4水平比較

        與對照組相比,模型組大鼠Claudin-1下降,TLR4上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組相比,抑制miR-449a組大鼠Claudin-1上升,TLR4下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與抑制miR-449a組相比,過表達miR-449a組大鼠Claudin-1上升,TLR4下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖5、6。

        a:與對照組比較,P<0.05;b:與模型組比較,P<0.05;c:與抑制miR-449a組比較,P<0.05

        2.6 各組大鼠p-p38、PPARγ、NF-κB蛋白表達

        與對照組相比,模型組大鼠PPARγ下降,p-p38、NF-κB上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組相比,抑制miR-449a組大鼠PPARγ上升,p-p38、NF-κB下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與抑制miR-449a組相比,過表達miR-449a組大鼠PPARγ上升,p-p38、NF-κB下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖7、8。

        圖6 各組大鼠Claudin-1及TLR4表達免疫組化圖片(×200)

        a:與對照組比較,P<0.05;b:與模型組比較,P<0.05;c:與抑制miR-449a組比較,P<0.05

        圖8 各組大鼠p-p38、PPARγ、NF-κB蛋白表達Western blot圖

        3 討論

        潰瘍性結腸炎的病因至今仍不明確,研究顯示,心理因素對于疾病惡化具有重要的作用[9]。潰瘍性結腸炎是一種自身免疫性疾病,其發(fā)病是由外源物引起的宿主反應、基因和免疫三者互相作用的結果[10-11]。潰瘍性結腸炎的病變局限于大腸黏膜及黏膜下層,病變位置大多位于乙狀結腸和直腸之間,也可以延伸到降結腸,最后可蔓延至整個直腸[12]。

        趨化因子家族是一種由細胞分泌的小細胞因子或信號蛋白[12-13],因其具有誘導附近反應細胞定向趨化的能力,而被命名為趨化細胞因子[14-15]。IL-8、IL-17、IL-10是臨床常見的趨化因子,對其進行檢測能夠對機體趨化因子的水平進行較為準確的評價[16]。本研究結果顯示,過表達miR-449a使IL-8、IL-17下降,IL-10上升,說明IL-8、IL-17、IL-10與潰瘍性結腸炎有著密切的聯(lián)系,過表達miR-449a可通過調節(jié)IL-8、IL-17、IL-10對潰瘍性結腸炎起到一定的治療效果。

        免疫球蛋白是指具有抗體活性或化學結構,與抗體成分較為相似的球蛋白[17],共分為5類,即IgG、IgA、IgM、免疫球蛋白D(immunoglobulin D,IgD)和免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)[18-19]。其中,IgA在血清中的含量僅次于IgG在黏膜組織內的含量[20]。IgM是分子量最大的免疫球蛋白,主要由脾和淋巴結中漿細胞分泌合成,在血清內無具體表達形式[21-22]。IgM具有強大的殺菌、激活補體、免疫調節(jié)和凝聚作用,也參與某些自身免疫病及超敏反應的病理過程。IgG主要分布于血清和組織液中,在人體血清中的含量最高,并且在血清中半衰期長[23-24],是人體免疫反應最重要的物質基礎,并且還是唯一能通過胎盤屏障的免疫球蛋白,對新生兒抗感染有著重要作用。本研究結果顯示,過表達miR-449a能夠使免疫球蛋白下降,說明過表達miR-449a可通過調節(jié)免疫球蛋白的表達改善機體免疫功能,增強機體免疫反應,起到治療潰瘍性結腸炎的作用。

        腫瘤壞死因子分2種,即TNF-α和TNF-β,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強的生物活性因子之一[25-26]。TNF-α是由單核—巨噬細胞分泌而成,能夠直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性。COX有至少2種同工酶,COX-1與COX-2,其中COX-1稱為固有性COX,COX-2稱為誘生型COX[27]。COX-2是一種雙功能酶,具有一定的環(huán)氧化酶和過氧化酶活性,是催化花生四烯酸轉化為前列腺素的關鍵酶[28]。炎癥損傷主要是由刺激單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等誘導觸發(fā)炎癥反應的關鍵因子COX-2合成導致。本研究結果顯示,過表達miR-449a組大鼠TNF-α、COX-2下降,由此表明過表達miR-449a可有效抑制潰瘍性結腸炎中炎癥反應蔓延,減輕機體損傷,證實潰瘍性結腸炎的發(fā)生與炎癥反應相關。

        miR-449a是miRNAs的一種,在正常情況下,miR-449a在肺、氣管、睪丸中高表達,在宮頸、食道中亦有所表達。正常情況下miR-449a在機體組織的分化、成熟過程中有著重要的調節(jié)功能。PPARγ是PPARs超家族成員的一種亞型,是臨床研究中被深入研究的亞型,有著復雜多樣的生物學功能,能夠參與腸道的運動。本研究結果顯示,過表達miR-449a之后,大鼠體內p-p38下降,PPARγ上升,NF-κB下降,說明過表達miR-449a能夠通過激活PPARγ,抑制p-p38/NF-κB通路,改善腸道運動,減少機體炎癥反應對腸黏膜的損傷,起到修復結腸組織的作用。

        Claudin-1表達于上皮細胞及神經周細胞中。有研究表示,Claudin-1能夠減輕腸道炎癥反應,促進結腸黏膜愈合,重建腸黏膜屏障的完整性[29]。TLR4是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質分子,也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁[30]。本研究結果顯示,過表達miR-449a組Claudin-1上升,TLR4下降,說明過表達miR-449a能夠通過改善Claudin-1、TLR4來促進腸黏膜愈合,修復腸黏膜。

        綜上所述,過表達miR-449a能夠通過調節(jié)p38-PPAPγ/NF-κB通路,有效抑制潰瘍性結腸炎的炎癥反應,減少炎癥因子表達,對腸黏膜起著修復、保護作用。

        猜你喜歡
        潰瘍性緩沖液結腸炎
        “結腸炎”背后的親子關系問題
        中老年保健(2022年5期)2022-08-24 02:37:30
        新型醋酸纖維素薄膜電泳緩沖液的研究
        卵磷脂/果膠鋅凝膠球在3種緩沖液中的釋放行為
        中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:12
        足底潰瘍性扁平苔蘚合并普禿一例
        中西醫(yī)結合治療潰瘍性結腸炎40例
        愈瘍消潰方治療潰瘍性結腸炎活動期30例
        辨證論治慢性腹瀉型結腸炎45例
        治療脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎30例
        2種緩沖液對血清蛋白醋酸纖維膜電泳效果對比研究
        含兩性離子緩沖液的組合物及其在電分析裝置和方法中的用途
        99久热re在线精品99 6热视频| 玖玖色玖玖草玖玖爱在线精品视频| 欧美成人国产精品高潮| 天天躁日日躁狠狠躁av| 无码成人片一区二区三区| 国产av熟女一区二区三区老牛| 久久99天堂av亚洲av| 中文在线8资源库| 一本一本久久a久久精品| 亚洲精品中文字幕尤物综合| 涩涩鲁精品亚洲一区二区| 日本乱偷人妻中文字幕| 久久精品国产精品青草色艺| 亚洲精品高清av在线播放 | 亚洲av网站在线观看一页| 韩日午夜在线资源一区二区 | 自拍偷拍一区二区三区四区| 亚洲处破女av日韩精品中出| 乱人伦人妻中文字幕无码| 日韩欧美国产丝袜视频| 亚洲中文字幕一区高清在线| 国产99久久久国产精品~~牛| 在线亚洲欧美日韩精品专区| 国产亚洲美女精品久久| 婷婷久久亚洲中文字幕| 在线亚洲高清揄拍自拍一品区| 国产欧美一区二区精品性色| 青青草极品视频在线播放| 97精品人妻一区二区三区在线| 国偷自产一区二区免费视频| 国产精品亚洲A∨天堂| 91青青草手机在线视频| 艳妇臀荡乳欲伦交换h在线观看| 又粗又大又黄又爽的免费视频| 40分钟永久免费又黄又粗| av手机在线观看不卡| 又长又大又粗又硬3p免费视频| 精品中文字幕制服中文| 精品国产免费一区二区久久| 18禁裸男晨勃露j毛网站| 欧美日韩人妻|