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        不同途徑移植骨髓間充質干細胞對慢性腎病大鼠腎臟纖維化的影響

        2021-10-27 06:17:36李嘉琦楊揚李天祎楊素萍夏春娟王家平
        天津醫(yī)藥 2021年10期
        關鍵詞:途徑

        李嘉琦,楊揚,李天祎,楊素萍,夏春娟,王家平△

        慢性腎臟?。╟hronic kidney disease,CKD)是一類發(fā)病率和病死率較高的慢性疾?。?]。研究顯示,炎癥反應導致的腎間質纖維化是CKD 主要的進展途徑之一,而炎癥小體激活后釋放的促炎細胞因子可促進纖維化的形成,其中核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like protein 3,NLRP3)炎癥小體已被證實與腎間質纖維化的發(fā)展有關[2]。隨著再生醫(yī)學的發(fā)展,干細胞療法展現(xiàn)出良好的應用前景。目前,骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)被廣泛研究,其調節(jié)免疫、抗炎等功能在多種疾病中可發(fā)揮修復作用[3]。但是,BMSCs 能否通過抑制NLRP3 炎癥小體來修復腎間質纖維化尚不明確。本研究旨在探討B(tài)MSCs 對阿霉素所致CKD大鼠腎臟的修復作用及其減輕纖維化的可能作用機制。

        1 材料與方法

        1.1 材料 50 只清潔級SD 雄性大鼠購自昆明醫(yī)科大學實驗動物中心。其中2 只4 周齡大鼠提供骨髓供體干細胞;余48 只8 周齡大鼠,體質量(300.18±14.27)g,其中36 只用于造模,12只作為假手術(SHAM)組。阿霉素購自Sigma公司;低糖培養(yǎng)基(L-DMEM)、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco 公司;BMSCs 成骨成脂誘導分化培養(yǎng)基購自賽業(yè)(蘇州)生物科技公司;HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒、0.25%胰蛋白酶購自武漢塞維爾生物科技公司;NLRP3、凋亡相關微粒蛋白[apoptosis-associated speck-like protein containing Caspase recruitment domain(CARD),ASC]、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)抗體購自賽默飛世爾科技有限公司;自動生化分析儀(日立7170型,日本)。

        1.2 BMSCs 制備 2 只4 周齡健康雄性SD 大鼠脫頸處死后置于75%乙醇中浸泡5 min。剪斷股骨、脛骨骨骺端,參照文獻[4]分離培養(yǎng)BMSCs。用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長方式,取第3代細胞進行成骨、成脂誘導分化培養(yǎng),流式細胞儀鑒定細胞表面抗原CD29、CD44、CD45及CD11b陽性率,合格的BMSCs應表達CD29和CD44,而不表達CD45和CD11b[5]。細胞傳代至4~6代,取生長至80%~90%融合的細胞備用。

        1.3 CKD 模型制作及分組 48 只8 周齡大鼠適應性飼養(yǎng)1周,其中36 只通過左腎切除+多次尾靜脈注射阿霉素進行CKD造模,大鼠全麻后俯臥位固定于超凈臺,逐層切開皮膚、肌肉,暴露左腎后切除;蘇醒后尾靜脈注入阿霉素造模,第一次劑量為3 mg/kg,2 周后同劑量再次注射;每周經(jīng)眼內眥靜脈取血檢測腎功能,以血肌酐、尿素氮、24 h 尿蛋白升高,取腎切片HE 染色光鏡觀察符合慢性腎病改變?yōu)樵炷3晒Γ?]。所有大鼠均造模成功,將大鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法分為模型(CKD)組、腎動脈移植BMSCs(A-M)組及尾靜脈移植BMSCs組(V-M)組,每組12 只。余12 只為SHAM 組,不切除左腎,僅行開腹及剝離腎包膜操作。

        1.4 各組干預方案 0.25%胰蛋白酶-EDTA將生長狀況良好的BMSCs消化后加入L-DMEM培養(yǎng)基終止消化,1 500 r/min離心5 min,棄上清液后磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞,吹打充分后制成2×106個/mL單細胞懸液保存?zhèn)溆?。A-M組大鼠參照文獻[7]在數(shù)字減影血管造影(digital subtraction angiography,DSA)透視下用無菌微導管(PE10)經(jīng)左側頸動脈插管至右腎動脈開口處,同時經(jīng)導管推注少量肝素后再推注BMSCs懸液500 μL,術后逐層縫合切口并肌內注射80萬U青霉素0.1 mL;V-M組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/kg)后俯臥位固定于操作臺,經(jīng)尾靜脈注射等量BMSCs 溶液;Sham 組大鼠腹腔注射10%水合氯醛后俯臥位固定于操作臺,經(jīng)尾靜脈注射500 μL生理鹽水。

        1.5 主要觀測指標

        1.5.1 大鼠血肌酐、尿素氮、24 h 尿蛋白檢測 分別于BMSCs移植后第7、14天的前1 d,將各組大鼠放入代謝籠中,收集24 h 尿液并儲存于-80 ℃冰箱。次日經(jīng)尾靜脈采血0.2 mL 常溫靜置 3 h,3 500 r/min 離心 15 min 分離血清,生化分析儀檢測血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白。

        1.5.2 腎臟組織病理損傷及纖維化程度檢測 各組于治療14 d末處死大鼠,迅速取出大鼠腎臟組織于10%福爾馬林緩沖溶液中固定24 h,將石蠟包埋的腎組織切成4 μm薄片,蘇木精和伊紅(HE)染色、Masson三色染色,光學顯微鏡觀察腎臟組織病理損傷及纖維化程度。參照Mizuguchi 等[8]方法對腎臟組織進行評分:0分為極少量或無病變;1分為輕度受損,纖維化范圍0~25%;2分為中度受損,纖維化范圍26%~50%;3分為重度受損,纖維化范圍≥51%。

        1.5.3 免疫組化檢測腎組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 表達情況 每組其余切片用免疫組織化學法染色。石蠟切片脫蠟至水,將組織切片放入盛滿檸檬酸抗原修復緩沖液(pH=6.0)的修復盒中,修復盒行抗原修復并自然冷卻后,切片放入3%過氧化氫溶液孵育25 min,洗滌3 次,用3%封閉緩沖液(BSA)均勻覆蓋組織,室溫封閉30 min。將切片稀釋后分別與 NLRP3(1∶150)、ASC(1∶150)、Caspase-1(1∶150)抗體在4 ℃下孵育過夜。PBS漂洗3次,每次5 min,滴加與一抗相應種屬的HRP 標記二抗(1∶150)覆蓋組織,室溫孵育50 min。滴加3,3′-二苯二甲酰肼(DAB)復染,梯度乙醇脫水后于光學顯微鏡下觀察。

        1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差()表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較用LSD-t法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 BMSCs 的分離純化與鑒定 倒置顯微鏡下可見SD大鼠BMSCs為均勻貼壁生長的梭形細胞,呈漩渦狀排列生長,傳代至第3 代經(jīng)流式細胞儀鑒定表型CD29 陽性率96.9%,CD44 陽性率98.9%,CD45 陽性率1.9%、CD11b陽性率2.2%,成骨、成脂誘導染色可見橘紅色鈣結節(jié)、紅色脂滴形成,符合間充質干細胞的主要生物學特征,見圖1。

        2.2 各組大鼠血肌酐、尿素氮、24 h 尿蛋白情況比較 CKD組、V-M組及A-M組7 d和14 d的血肌酐、尿素氮、24 h 尿蛋白表達水平依次降低,但均高于SHAM組(P<0.05),見表1。

        2.3 各組大鼠腎臟病理表現(xiàn)及纖維化程度 SHAM組HE染色未見明顯病理改變,腎小球血管袢薄且清晰,腎小管形態(tài)正常,Masson三色染色未見膠原纖維沉積,纖維化評分0分;CKD組腎小球損傷部分可見空泡變性,系膜細胞和基質可見增生,出現(xiàn)局灶節(jié)段性硬化,腎小管萎縮,Masson 三色染色可見腎小球囊、小管間質周邊大面積膠原增生,可見大量藍色著染膠原纖維,纖維化評分 3 分;A-M 組、V-M 組可見腎小球可見不同程度萎縮,腎小管間質可見少量輕-中度淋巴細胞、漿細胞浸潤并伴有結締組織增生,其中 A-M 組病理學形態(tài)較 V-M 組輕微,A-M 組、V-M組Masson 三色染色均可見藍色著染膠原纖維,V-M組纖維化評分2分,A-M組纖維化評分1分,見圖2。

        2.4 各組大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1 表達水平比較 SHAM組大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1表達均呈陰性;CKD 組、V-M 組、A-M 組大鼠 NLRP3、ASC、Caspase-1 表達均呈陽性,但陽性細胞數(shù)依次降低,見圖3。

        3 討論

        Fig.1 Morphology of the 3rd generation,staining for osteogenic differentiation and adipogenic differentiation(×100)圖1 第3代BMSCs細胞形態(tài)、成骨誘導分化染色及成脂誘導分化染色(×100)

        Tab.1 Comparison of serum creatinine,urea nitrogen and 24 h urinary protein after BMSCs transplantation between the four groups表1 各組大鼠血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白比較 (n=12,)

        Tab.1 Comparison of serum creatinine,urea nitrogen and 24 h urinary protein after BMSCs transplantation between the four groups表1 各組大鼠血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白比較 (n=12,)

        *P<0.05,**P<0.01;a與SHAM組比較,b與CKD組比較,c與V-M組比較,P<0.05

        組別SHAM組CKD組V-M組A-M組F血肌酐(μmol/L)7 d 34.72±3.54 94.76±3.61a 86.80±2.97ab 68.68±3.77abc 701.718**14 d 33.97±3.54 106.59±7.56a 100.63±5.66ab 90.96±2.82abc 485.438**尿素氮(mmol/L)7 d 2.54±0.19 7.80±0.25a 5.78±0.39ab 3.74±0.49abc 510.003**14 d 2.63±0.55 6.95±0.40a 6.22±0.19ab 5.79±0.18abc 317.993**24 h尿蛋白(mg)7 d 25.30±0.65 54.23±1.65a 40.08±1.77ab 30.76±2.17abc 696.089**14 d 26.53±1.42 50.51±1.75a 39.04±2.49ab 36.29±2.11abc 295.399**

        Fig.2 Pathological manifestations of renal tissues in the four groups(×200)圖2 各組大鼠腎組織病理表現(xiàn)(×200)

        Fig.3 Immunohistochemical staining results of NLRP3,ASC and Caspase-1 in the four groups(×200)圖3 各組大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1免疫組化染色結果(×200)

        CKD 容易進展為終末期腎?。╡nd stage renal disease,ESRD),后者往往需要透析、腎移植等腎替代療法。維持性透析治療不能完全替代腎臟功能,而腎移植由于供體、費用問題也不能廣泛開展。BMSCs因其易于取材、體外擴增方便、具有多向分化潛能,成為疾病治療的新選擇。目前,常用的BMSCs移植途徑包括靜脈途徑、動脈途徑和局部注射,然而不同途徑對BMSCs 的治療效果的影響不同,對于移植途徑仍然存在爭議。李芳等[9]在用臍帶血干細胞治療犬腎損傷模型中發(fā)現(xiàn),動脈途徑和靜脈途徑治療效果無明顯差別。龔勇泉等[10]在小鼠心臟移植模型中發(fā)現(xiàn),BMSCs 動脈途徑移植較靜脈及心肌局部注射更能延長移植心臟存活時間。謝周滔等[11]在小鼠腎缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn),靜脈途徑移植BMSCs較動脈途徑效果更佳,創(chuàng)傷較小。因此,BMSCs通過何種移植途徑能較好地改善CKD 大鼠腎功能及其減輕或延緩腎間質纖維化的機制尚有待進一步研究。本研究結果顯示,A-M 組、V-M 組與 CKD 組相比腎功能(血肌酐、尿素氮、24 h 尿蛋白)改善,A-M組效果優(yōu)于 V-M 組;HE 染色、Masson 三色染色顯示,BMSCs移植后腎臟炎性浸潤減輕,纖維化程度降低,A-M 組改善程度優(yōu)于V-M 組,表明經(jīng)腎動脈途徑移植效果優(yōu)于經(jīng)尾靜脈途徑。筆者分析可能與移植細胞在體內分布數(shù)量不同有關,通過介入方法經(jīng)動脈途徑注射后大量干細胞可直接進入受損腎組織,避免了外周靜脈途徑所必經(jīng)的肺循環(huán)過程,增加了歸巢細胞數(shù)量。傳統(tǒng)的直接腎動脈穿刺途徑注射雖然在實驗中可行,但在實際操作中存在一些限制,如大鼠體積較小,穿刺可能撕裂腎動脈,造成術中大出血或者腎動脈內膜損傷,進而導致腎動脈狹窄,甚至閉塞。因此,相較于傳統(tǒng)開腹直接注射方法,本研究通過介入途徑經(jīng)左頸總動脈腎動脈途徑注入BMSCs有著精準、微創(chuàng)的優(yōu)勢。

        現(xiàn)代醫(yī)學認為,持續(xù)性炎癥是慢性腎損傷重要標志,無菌性炎癥是CKD的臨床特征[12]。炎癥小體是Nod樣受體家族蛋白與PYHIN家族蛋白組成的細胞質多蛋白復合物,在先天免疫中起重要作用,其中NLRP3炎癥小體在調節(jié)炎癥反應及腎間質纖維化中的作用受到廣泛關注。NLRP3 炎癥小體由NLRP3、ASC 和 pro-caspase-1 構成。研究發(fā)現(xiàn),至少有 2 種信號是NLRP3炎癥小體激活所必需:(1)由Toll樣受體或細胞因子如腫瘤壞死因子α識別的微生物配體介導,激活核因子途徑,引起NLRP3蛋白水平上調。(2)由各種病原相關分子模式和損傷相關分子模式刺激介導,進而促進ASC 和pro-Caspase-1 的組裝,誘導NLRP3炎癥小體活化[13]。因此,在慢性腎損傷過程中會有NLRP3、ASC、Caspase-1 的陽性表達水平的升高。Ke 等[14]發(fā)現(xiàn),在 CKD 患者的腎臟中,NLRP3和Caspase-1的表達水平顯著升高,表明活化的NLRP3 炎癥小體可能參與腎間質纖維化調節(jié)。部分研究發(fā)現(xiàn),NLRP3 炎癥小體可導致5/6 腎切除模型和晶體性腎病的腎間質纖維化[15-16]。研究顯示,小鼠敲除NLRP3基因或使用NLRP3炎癥小體活性抑制劑MCC950 抑制炎癥小體表達后,小鼠腎間質纖維化程度均減輕[17-18]。本研究結果發(fā)現(xiàn),NLRP3、ASC、Caspase-1 在單側腎切除并多次阿霉素注射的腎間質纖維化模型中表達呈陽性,表明其參與了腎間質纖維化的進程;免疫組化結果顯示,BMSCs 移植后NLRP3、ASC、Caspase-1 表達降低,故筆者推測BMSCs 可能通過抑制NLRP3 炎癥小體活性來減輕大鼠的腎間質纖維化。

        綜上所述,BMSCs移植療法可改善大鼠腎功能,減輕組織纖維化程度,且經(jīng)腎動脈途徑移植優(yōu)于經(jīng)尾靜脈途徑。單側腎切除并多次阿霉素注射的腎間質纖維化模型中NLRP3炎癥小體成分增加。BMSCs可能是通過降低NLRP3、ASC、Caspase-1 表達來改善CKD大鼠腎功能。

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