田 瑛 鄧小敏 蘇 冬 王振剛 方桂玉 毛發(fā)林

(1 廣西中醫(yī)藥大學研究生院，南寧市 530001，電子郵箱:1244897242@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院內分泌科，南寧市 530023)

近年來，糖尿病已成為繼癌癥、心血管疾病之后的威脅人類健康的第三大疾病。相關流行病學調查顯示，糖尿病患病率及致死率呈逐年上升趨勢[1]；新近發(fā)布的國際糖尿病聯(lián)盟2019全球糖尿病地圖(第9版)顯示，全球約4.63億人罹患糖尿病，中國位居全球首位，患者數(shù)量達1.16億[2]。目前尚無有效治愈糖尿病的方案，西藥降糖臨床效果好，但長期使用副作用大且易產生藥物依賴，不能有效預防及控制并發(fā)癥[3]。相關研究表明，中藥治療控制血糖有效，副作用少[4]，可有效預防及治療糖尿病并發(fā)癥[5]。增液湯(玄參、生地黃、麥冬)作為臨床廣泛應用的中藥湯劑，前期已有實驗表明其能降低糖尿病小鼠的血糖，并改善糖尿病小鼠的糖耐量[6]。但目前增液湯的降糖機制尚未明確，這限制了增液湯在國內外臨床的廣泛應用。而中藥復方的多藥物、多成分、多靶點特點與網(wǎng)絡藥理學的研究方法相契合，網(wǎng)絡藥理學為中藥的系統(tǒng)研究提供了具體方法[7-8]。因此，本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法分析增液湯治療糖尿病的作用機制。

1 資料與方法

1.1 活性化合物的篩選 運用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)篩選增液湯3味中藥(包括玄參、生地黃、麥冬)的活性化合物。篩選條件：生物利用度(oral bioavailability，OB)表示口服的藥物到達血液循環(huán)所占口服劑量的比例，一般是決定生物活性分子類藥性的關鍵指標，因而設置OB≥30%；具有較高的類藥性(drug likeness，DL)的化合物才能在口服吸收過程中被安全送達靶器官發(fā)揮其生物學效應，因而設置DL≥0.18；剔除沒有相關信息的化學成分。

1.2 活性化合物的靶點預測 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫收集增液湯活性化合物的作用靶點，使用 UniProt(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫對所有靶點名稱進行標準化校正。

1.3 糖尿病相關基因的篩選 使用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)對糖尿病相關的基因進行篩選，匯總、去重后，將增液湯活性化合物的作用靶點網(wǎng)絡映射到糖尿病相關靶點網(wǎng)絡中，2個網(wǎng)絡中重疊的基因即被認為是增液湯中藥活性成分干預糖尿病的靶點。

1.4 可視化網(wǎng)絡構建 將篩選出的增液湯活性成分及其靶點以及糖尿病的相關基因導入Cytoscape 3.6.1軟件，構建增液湯“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡。網(wǎng)絡圖中“節(jié)點(node)”代表增液湯中的活性成分和作用靶點，“邊(edge)”代表活性成分、作用靶點間的相互關系。并對可視化網(wǎng)絡進行網(wǎng)絡拓撲學分析，其中，靶點度值(Degree)和中介中心度是拓撲結構中兩個重要的參數(shù)，可用于評價增液湯有效化合物、靶標的重要程度。度值和介數(shù)中心數(shù)越大，說明靶點越處于PPI網(wǎng)絡中心，發(fā)揮關鍵作用。圖中靶點圓越大，表明度值和介數(shù)中心數(shù)越大。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡的構建 將增液湯活性成分作用靶點和糖尿病相關基因重疊的靶點上傳至在線分析工具STRING(https://string-db.org/)，參數(shù)設置評分條件≥0.7(高等置信度)，隱藏圖中游離的蛋白質，輸出string_interactions.tsv文件，導入Cytoscape以增強其可讀性，獲取蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)信息，根據(jù)在string中設置的高等置信度的篩選條件明確PPI網(wǎng)絡中的關鍵蛋白。

1.6 增液湯治療糖尿病相關基因的功能分析和通路分析 利用在線分析工具DAVID(Version 6.8，https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體(Gene Ontology,GO)分析，包括生物過程、細胞成分、分子功能，選擇P<0.05的項目進行分析，采用GraphPad Prism 8.0軟件將這些條目做成可視化條形圖。利用DAVID平臺進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析，將結果導入在線分析平臺OmicShare(http://www.omicshare.com)，對增液湯治療糖尿病相關基因的核心通路進行篩選及注釋。

2 結 果

2.1 活性化合物篩選結果和靶點預測結果 最終獲得243個活性化合物進行后續(xù)分析。243個活性化合物共得到212個作用靶點，與獲得的251個糖尿病相關的基因進行映射，得到49個重疊靶點，見圖1。

圖1 增液湯活性成分作用靶點與糖尿病相關基因的共有靶點韋恩圖

2.2 可視化網(wǎng)絡和PPI網(wǎng)絡圖 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡見圖2。根據(jù)藥物-靶標相互作用預測的靶標預測算法給出的評分遞減順序對其預測的候選靶標進行排序。分數(shù)為%3E=“分數(shù)截止”的預測候選目標(包括由藥物數(shù)據(jù)庫、KEGG和TTD支持的已知直接目標)將被假設為查詢化合物的潛在目標。建立增液湯中藥藥活性成分干預糖尿病的靶點的PPI網(wǎng)絡圖(見圖3)，涉及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、鼠雙微粒體2(murine double minute 2,MDM2)、表皮細胞生長因子(epidermal growth factor,EGF)等多個關鍵靶點。

圖2 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡圖

圖3 PPI網(wǎng)絡圖

2.3 增液湯治療糖尿病相關基因的GO分析結果 對增液湯治療糖尿病的49個候選靶點進行GO富集分析。在滿足FDR<0.01條件下，生物過程共有29條，包括細胞對外來刺激的反應、對活性氧的反應、氧化應激的細胞反應、神經元死亡的調節(jié)等；分子功能共有4條，包括薄膜筏、膜微域、膜區(qū)域等；細胞組分共有6條，包括泛素蛋白連接酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合、磷酸酶結合等。將排名靠前的3個條目繪制成條形圖，見圖4。

圖4 GO分析結果(前3條)

2.4 增液湯治療糖尿病相關基因的KEGG富集分析和核心通路篩選結果 共富集出58條信號通路，包括磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號通路和缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)信號轉導通路等，見圖5、圖6、圖7。

圖5 KEGG分析結果(根據(jù)FDR校正后得的P值進行排列，選前20條)

圖6 PI3K-Akt信號轉導通路

圖7 HIF-1信號轉導通路

3 討 論

糖尿病屬中醫(yī)“消渴病”范疇，以多飲、多食、多尿、形體消瘦為主要特征?！吨T病源候論》提到“五臟六腑，皆有津液。若臟腑因虛實而生熱者，熱氣在內，則津液竭少，故渴也”。消渴形成的關鍵在于“津液竭”，津液敷布失常，引起津不上承煩渴多飲，津液直趨下行頻數(shù)多尿，肌膚失潤“消肌膚”而形體消瘦。增液湯首載于《溫病條辨》，有增液潤燥之效，可解消渴病之津傷液竭[9]，但其降糖的作用機制尚不明確。中藥復方具有藥味多，成分復雜，通過調整藥量、炮制方法、配伍等多因素治療疾病的特點。而網(wǎng)絡藥理學以“多成分-多靶點-多途徑”為網(wǎng)絡構建思想，與中藥復方的特點不謀而合，為中藥復方的研究提供了新方向[10-11]。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法，共篩選出增液湯活性成分與相關基因的共同靶點49個，包括Akt1、MDM2等多個關鍵靶點。其中，Akt1參與多種生物學過程，包括代謝、增殖、細胞存活、生長、胰島素信號傳導和血管生成等[12]，其激活依賴于PI3K途徑，并被認為是該途徑的中心節(jié)點。麥冬皂苷為增液湯中麥冬的主要有效成分之一[13]，其可能是通過抑制Akt1及其下游蛋白哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)以增強心肌細胞的自噬能力，從而改善糖尿病大鼠的心臟功能[14]。p53作為腫瘤抑制因子，活化后通過參與糖代謝、脂肪酸代謝等途徑而在代謝平衡調控中發(fā)揮重要作用。而MDM2癌基因是p53的負性調節(jié)因子[15]，其能通過抑制p53來抑制糖尿病腎病小鼠核因子紅系2相關因子2的抗氧化活性，以達到預防糖尿病腎病的目的[16]，這提示激活MDM2和抑制p53或為防治糖尿病腎病的新方向。

我們進一步針對增液湯作用于糖尿病的49個作用靶點進行GO分析，發(fā)現(xiàn)作用靶點涉及細胞對外來刺激的反應、對活性氧的反應、氧化應激的細胞反應、神經元死亡的調節(jié)等生物過程，薄膜筏、膜微域、膜區(qū)域等細胞組分，泛素蛋白連接酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合、磷酸酶結合等分子功能。糖尿病是一種與營養(yǎng)過剩有關的疾病，是一種常見的代謝紊亂，通常先于代謝綜合征發(fā)生，與胰島素抵抗、血脂異常和高血壓等相互關聯(lián)[17]。代謝性炎癥與各種細胞內應激有關，例如線粒體氧化應激、內質網(wǎng)應激、自噬缺陷[18]。而炎癥也是糖尿病中的一個基本生物學過程。因此，適當調節(jié)這些機制對于防止初始炎癥反應不受控制以及疾病發(fā)展至關重要[19]。

本研究中，KEGG分析富集出了58條信號通路，包括絲裂原活化蛋白激酶信號通路、PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、mTOR信號通路等，其中PI3K-Akt信號通路是2型糖尿病發(fā)生和發(fā)展的經典通路。Yang等[20]發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽改善糖尿病大鼠認知障礙的作用機制可能與激活絲裂原活化蛋白激酶和PI3K-Akt信號通路有關。師林等[21]通過檢測存在胰島素抵抗的脾虛痰濕型肥胖2型糖尿病大鼠的血脂、血糖水平及蛋白情況，發(fā)現(xiàn)該藥方可能通過良性調節(jié)PI3K-Akt信號通路調節(jié)糖脂代謝，改善胰島素抵抗。因此，我們推測增液湯可能主要通過激活其下游分子Akt1以調節(jié)PI3K-Akt信號通路，從而促進胰島素的分泌、改善胰島功能等過程，進而發(fā)揮對2型糖尿病的干預作用。

綜上所述，增液湯治療糖尿病具有多靶點、多通路作用的特點，其可能是通過激活下游分子Akt1，調節(jié)PI3K-Akt信號通路，促進胰島素的分泌、改善胰島功能等過程，對糖尿病進行干預。本研究利用多個數(shù)據(jù)庫綜合分析，所得結果有一定置信度，但中藥復方的功效與其中各藥物的產地、炮制方法、配伍、煎藥方式、用藥劑量等因素密切相關，中醫(yī)遵從“因人、因時、因地”三因制宜的治療方法，這使得中藥復方起效的機制復雜化。本研究僅對增液湯本身的化合成分及作用靶點等進行分析，尚未涉及藥物與人、時、地的相互作用，不能完全詮釋中藥復方的精髓所在。但采用網(wǎng)絡藥理學對中藥復方進行化合物分析、作用靶點預測、信號通路富集等將提高中醫(yī)藥的國際認可度，更好地推動中醫(yī)藥走向世界。