羅澤琴 田興中 張曉飛 司華清

(河北省張家口市第五醫(yī)院肛腸科，張家口市 075000，電子郵箱：lzq32156@163.com)

肛周膿腫是由細菌感染引發(fā)的急性或慢性化膿性疾病，其發(fā)病部位包括肛門、肛管及直腸周圍軟組織[1]。肛周膿腫主要表現(xiàn)為肛門灼熱、排便疼痛等，若治療不當(dāng)會導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作，甚至發(fā)生感染性休克，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。目前，肛周膿腫的主要治療手段為膿腫切開引流術(shù)，但由于病變位置特殊,患者術(shù)后創(chuàng)面愈合緩慢[3]，因此，迫切需要尋找有效的藥物以促進肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面的愈合。研究表明，Notch1信號通路能夠促進角質(zhì)形成細胞的遷移和增殖，在促進皮膚傷口愈合和組織修復(fù)中起至關(guān)重要的作用[4]。生肌膏在臨床上主要用于慢性創(chuàng)面愈合，可促進創(chuàng)面肉芽組織生長，效果顯著[5]，但其促進肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合的效果及作用機制是否與Notch1信號通路相關(guān)尚不明確。本研究通過建立肛周膿腫大鼠術(shù)后創(chuàng)面模型，探討生肌膏促進肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合的效果及作用機制，以期為肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實驗動物：無特定病原體級SD大鼠65只，8周齡，體重(200.0±10.0)g，均為雌性，購自上海劍鈍生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2019-0027。經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，并遵守3R保護原則進行實驗。

1.1.2 主要藥品與試劑：生肌膏由本院藥房自制，主要成分有生血余60 g、爐甘石250 g、象皮90 g、生地黃120 g、當(dāng)歸60 g、生石膏150 g、龜甲120 g；Masson三色染色試劑盒(批號：G1340)、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)試劑盒(批號：G1120)、RIPA裂解液(批號：R0010)、ECL發(fā)光液(批號：PE0010)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(批號：SEKH-0047)、白細胞介素(interleukin，IL)-1α ELISA試劑盒(批號：SEKH-0001)、IL-6 ELISA試劑盒(批號：SEKH-0013)均購自北京Solarbio公司；Notch1兔抗大鼠多克隆抗體(批號：PA5-95827)和β-肌動蛋白(β-actin)兔抗大鼠多克隆抗體(批號：PA1-183)和山羊抗兔lgG(H+L)二級抗體(批號：A32731)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3 主要儀器：CX41生物顯微鏡購自日本Olympus公司；Gel DocTMXR+型凝膠成像儀和T100型PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備：參考文獻[6]制備肛周膿腫大鼠術(shù)后創(chuàng)面模型。使用隨機數(shù)字法隨機選取45只大鼠，采用1.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)進行麻醉后固定于操作臺，碘附常規(guī)消毒，局部備皮，在大鼠背部取直徑為1.5 cm的創(chuàng)面?zhèn)?，深至肌層，止血后滴?.0 mL糞液(正常人新鮮糞便20 g溶解于10 mL生理鹽水，5 000 r/min離心10 min后取上清液)，用醫(yī)用紗布覆蓋創(chuàng)面，固定48 h，于(60.0±5.0)%濕度、光照與黑暗每12 h交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，創(chuàng)口出現(xiàn)膿性分泌物，有糞臭味即為建模成功。本研究建模成功40只大鼠，經(jīng)手術(shù)清除膿腫，生理鹽水清洗，紗布覆蓋48 h后用于后續(xù)實驗。

1.2.2 實驗分組及創(chuàng)面處理：將40只建模成功的大鼠按隨機數(shù)字法分為模型組(n=20)和生肌膏治療組(n=20)。肛周膿腫術(shù)后48 h，每天清晨在創(chuàng)生肌膏治療組大鼠面滴加人新鮮糞液0.5 mL，30 min后用生理鹽水清洗，碘附消毒并外涂厚度約為1 mm生肌膏完全覆蓋創(chuàng)面，更換紗布，持續(xù)18 d。模型組大鼠每天在相同時間、相同方法給予術(shù)后創(chuàng)面滴加糞液、清洗并消毒，更換紗布，但不給予藥物處理，持續(xù)18 d。取剩余20只大鼠按照1.2.1方法僅在大鼠背部行直徑為1.5 cm的創(chuàng)面?zhèn)冢吹渭蛹S液，每天在相同時間滴加生理鹽水0.5 mL，消毒后更換紗布，設(shè)置為對照組。

1.2.3 創(chuàng)面形態(tài)學(xué)觀察：于每次換藥或更換紗布時，按隨機數(shù)字法選取各組10只大鼠觀察術(shù)后創(chuàng)面組織的腫脹程度、組織生長狀態(tài)等，估算大鼠在創(chuàng)面處理前(切除膿腫48 h后即刻)以及創(chuàng)面處理后3 d、8 d、13 d和18 d的創(chuàng)面面積，計算愈合率。愈合率=[(切除膿腫48 h時的創(chuàng)面面積-觀察時的創(chuàng)面面積)/建模成功時的創(chuàng)面面積]×100%。

1.2.4 Masson染色實驗：分別于創(chuàng)面處理后3 d、13 d，按隨機數(shù)字法處死各組大鼠5只，取大鼠肛周膿腫術(shù)后愈合組織，行石蠟包埋、切片，根據(jù)Masson試劑盒說明書對組織切片進行染色，顯微鏡下觀察組織病理狀態(tài)。生肌膏處理后18 d，處死各組剩余大鼠，按照上述方法獲取各組肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合組織，一部分用于制作切片，作Masson染色用于后續(xù)實驗，將其余組織置于-80℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 HE染色觀察大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合組織表皮生長情況：選取1.2.4中各時間點的大鼠愈合組織切片，經(jīng)HE染色后，顯微鏡下觀察毛細血管和成纖維細胞變化情況。

1.2.6 實時熒光定量PCR法檢測Notch1 mRNA的相對表達水平：取1.2.4中-80℃保存的各組大鼠創(chuàng)面組織90 mg，解凍勻漿后，4℃下10 000 r/min離心10 min取上清液，使用RNeasy Mini Kit(上海北諾生物科技有限公司，批號：74106)提取各組總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA(反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上?？泼羯锟萍加邢薰荆枺?05311)，然后進行實時熒光定量PCR反應(yīng)(PCR試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司，批號：QP-01011)，以β-actin為內(nèi)參，測定Notch1 mRNA相對表達水平。Notch1 mRNA和β-actin引物序列均由生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成，見表1。反應(yīng)體系共24 μL；反應(yīng)條件：50℃、2 min，95℃、10 min，95℃、15 s，40個循環(huán)，60℃、1 min退火。以2-ΔΔCt計算Notch1 mRNA相對表達水平。

表1 Notch1和β-actin引物序列

1.2.7 蛋白免疫印跡實驗檢測Notch1蛋白相對表達量：取1.2.4中-80℃保存的各組大鼠創(chuàng)面組織30 mg，制備勻漿液，使用RIPA裂解液提取各組組織總蛋白，二喹啉甲酸法檢測蛋白總量，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、TBST清洗后，依次加入一抗Notch1(1∶800)和β-actin(1∶1 000)，低溫過夜，加入二抗(1∶5 000)孵育2 h，TBST清洗后，曝光顯影，采用Gel DocTMXR+型凝膠成像儀分析各組條帶，Notch1蛋白相對表達量=Notch1條帶灰度值/β-actin灰度值。

1.2.8 ELISA法檢測TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平：取1.2.4中-80℃保存的各組大鼠創(chuàng)面組織0.05 g，制備勻漿液，根據(jù)TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒說明書，檢測各組肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 25.00軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面形態(tài)學(xué)及創(chuàng)面愈合率的比較 創(chuàng)面處理后3、8、13和18 d，3組大鼠的創(chuàng)面愈合率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，其中創(chuàng)面處理后3、8、13和18 d，3組大鼠創(chuàng)面愈合率由高到低均為生肌膏治療組、對照組、模型組(均P<0.05)。創(chuàng)面處理后3、8、13和18 d，與對照組相比，模型組創(chuàng)口愈合緩慢；與模型組相比，生肌膏治療組大鼠創(chuàng)口愈合情況明顯增加，創(chuàng)口減小，且愈合效果優(yōu)于對照組。見圖1和表2。

建模成功時 創(chuàng)面處理后3 d 創(chuàng)面處理后8 d 創(chuàng)面處理13 d 創(chuàng)面處理第18天

表2 不同時間點3組大鼠創(chuàng)面愈合率的比較(x±s，%)

2.2 3組大鼠的創(chuàng)面組織學(xué)變化 Masson染色法結(jié)果顯示：隨時間的延長，各組大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面組織的膠原纖維合成數(shù)量呈增加趨勢；相同時間點，模型組膠原蛋白的形成速率最慢、數(shù)量最少，生肌膏治療組的膠原纖維合成數(shù)量最多，對照組次之。見圖2。HE染色結(jié)果提示：隨時間的延長，各組大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面組織表皮生長狀態(tài)逐步改善，表皮厚度逐漸增加；同一時間點，模型組大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面組織表皮生長狀態(tài)最差，表皮厚度最??；生肌膏治療組大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面組織表皮厚度明顯增加，表皮組織形態(tài)明顯完善，對照組介于模型組和生肌膏治療組之間。見圖3。

圖2 3組大鼠創(chuàng)面愈合組織學(xué)變化(Masson染色，×200)

圖3 3組大鼠創(chuàng)面組織HE染色結(jié)果(×200)

2.3 3組大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面組織Notch1蛋白及mRNA相對表達水平的比較 3組大鼠創(chuàng)面組織的Notch1蛋白及mRNA相對表達水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，其中生肌膏治療組、對照組、模型組大鼠創(chuàng)面組織的Notch1蛋白及mRNA相對表達水平均依次降低(均P<0.05)。見圖4和表3。

圖4 3組大鼠創(chuàng)面組織中Notch1蛋白表達的電泳圖

表3 3組大鼠創(chuàng)面組織Notch1 mRNA和蛋白相對表達水平的比較(x±s)

2.4 3組大鼠創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平的比較 3組大鼠創(chuàng)面的TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，其中模型組、對照組、生肌膏治療組大鼠創(chuàng)面組織的TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平均依次降低(均P<0.05)。見表4。

表4 3組大鼠創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平的比較(x±s，pg/mL)

3 討 論

肛周膿腫屬于臨床常見肛腸科疾病，主要由葡萄糖球菌、大腸桿菌、鏈球菌或其他厭氧細菌感染引起[7]。手術(shù)治療肛周膿腫后創(chuàng)面容易發(fā)生水腫、疼痛和炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險增高，而有效的術(shù)后藥物治療是肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵[8]。南宋時期，《外科精要》記載“治谷道前后生癰,謂之懸癰”，將肛周膿腫命名為“懸癰”；至清代《醫(yī)門補要》中提出“肛癰”病名，一直被后代醫(yī)家沿用至今[9]。生肌膏是中醫(yī)常用的傷口愈合治療藥方之一，包含當(dāng)歸、甘草、白芷、紫草和血竭等重要成分，具有很好的臨床療效[10]。李志等[11]研究發(fā)現(xiàn)，濕潤生肌膏能夠促進肛瘺術(shù)后創(chuàng)口肉芽組織形成，加快傷口愈合；賈湘隆等[12]的研究表明，回陽生肌膏對糖尿病大鼠陰證瘡面愈合具有促進作用；此外，還有研究表明清熱生肌膏可保護Ⅱ度燒傷大鼠傷口愈合[13]。本研究結(jié)果顯示，給予生肌膏治療后，生肌膏治療組大鼠肛周膿腫創(chuàng)面愈合率高于模型組(均P<0.05)，提示生肌膏對肛周膿腫創(chuàng)面愈合具有促進作用。Masson和HE染色結(jié)果顯示，采用生肌膏治療后，生肌膏治療組大鼠創(chuàng)面組織中膠原形成情況和表皮生長速率均優(yōu)于模型組，表明生肌膏有助于肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面中的膠原重塑和表皮生長，從而促進肛周膿腫術(shù)后的創(chuàng)面愈合。

Notch1信號通路是一類高度保守的信號途徑，參與各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展[14-15]。近年來，越來越多研究證實，Notch1基因的激活可能與皮膚傷口愈合密切相關(guān)[16-18]。Na等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Notch1在皮膚傷口邊緣表達上調(diào)，其表達減少或失活均不利于皮膚傷口愈合；而激活Notch1途徑或可通過促進角質(zhì)形成細胞的增殖和遷移，從而促進皮膚傷口愈合[17]。此外，堿性成纖維生長因子可以通過上調(diào)Notch1蛋白表達，改善傷口愈合質(zhì)量并減輕疤痕[18]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面組織Notch1蛋白及mRNA相對表達量均低于對照組(均P<0.05)，提示Notch1表達下調(diào)可能與大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合不佳相關(guān)；而生肌膏治療組大鼠的肛周膿腫創(chuàng)面組織Notch1蛋白及mRNA相對表達量均高于模型組，提示生肌膏可能通過激活Notch1信號通路，加速肛周膿腫大鼠術(shù)后傷口的愈合。

創(chuàng)面組織中的炎癥反應(yīng)對于對感染的發(fā)生具有重要影響，其會導(dǎo)致的傷口難以愈合或產(chǎn)生疤痕[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的創(chuàng)面組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平均高于對照組(均P<0.05)，提示在肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合過程中，創(chuàng)面愈合組織中存在炎癥反應(yīng)；而與模型組相比，生肌膏治療組大鼠創(chuàng)面組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平均降低(均P<0.05)，提示生肌膏對肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合的促進作用，可能與降低炎癥因子表達有關(guān)。

綜上所述，生肌膏可能通過激活Notch1信號通路、減輕創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，促進肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面的愈合。這表明生肌膏對肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面具有潛在的治療價值，但臨床肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合受環(huán)境影響較大，且易被細菌感染，因此生肌膏對該疾病的治療效果及作用機制有待更深入的研究以證實。