謝華斌 葛高順 王瑩瑩 方宜臻 馬芳芳 倪二茹,3

(1 廈門大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院檢驗科，福建省廈門市 361008，電子郵箱：xmsccl@126.com；2 廈門市心血管疾病精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點實驗室，福建省廈門市 361008；3 廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建省廈門市 361000)

先天性心臟病(congenital heart disease,CHD)是一種最常見的出生缺陷性疾病，其中80%為單純性CHD，即僅有心臟的發(fā)育畸形或缺陷，而沒有其他部位的發(fā)育異常[1-3]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個可能與CHD發(fā)病有關(guān)的基因，其中NK2同源異型框5(NK2 homeobox 5,NKX2-5)、GATA結(jié)合蛋白4(GATA binding protein 4,GATA4)和T盒轉(zhuǎn)錄因子5(T-box transcription factor 5,TBX5)是心臟早期發(fā)育過程中的3個重要轉(zhuǎn)錄因子。有研究提示，這3個基因參與室間隔缺損和房間隔缺損的發(fā)生和發(fā)展[4]，且三者相互作用，共同調(diào)控心臟特異基因的表達(dá)[5-7]。其中，NKX2-5的基因突變可引起房室傳導(dǎo)缺陷和房間隔缺損，可導(dǎo)致左心發(fā)育不良綜合征、右室雙出口和法洛四聯(lián)癥等多種不同類型的CHD[4-7]。最近研究還有表明CHD的發(fā)生與NKX2-5基因的63位堿基的A突變?yōu)镚有關(guān)[8]，但其具體機(jī)制尚未明確。本研究探討NKX2-5基因63A>G突變對CHD相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，為闡明NKX2-5基因與CHD發(fā)病的關(guān)系提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 P19細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞(美國菌種保藏中心，ATCC)；PLVX-puro-MCS-GFP質(zhì)粒(美國Addgene公司，批號：128652)；psPAX2質(zhì)粒(美國Addgene公司，批號：12260)和pMD2G質(zhì)粒(美國Addgene公司，批號：12259)；DH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根生物公司，批號：CB101-02)；BamHⅠ限制性內(nèi)切酶(美國Thermo公司，批號：FD0054)和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶(美國Thermo公司，批號：FD0274)；NKX2-5 cDNA(Sino Biological公司，批號：HG12354-ANG)；T4連接酶(美國Thermo公司，批號：15224017)；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM；美國Gibco公司，批號：11965092)；點突變試劑盒(碧云天公司，批號：D0208S)；瓊脂糖(北京索萊寶生物公司，批號：9012-36-6)；Turbofect轉(zhuǎn)染試劑(美國Thermo公司，批號：R0534)；聚凝胺(美國Sigma公司，批號：TR-1003-G)；蛋白酶抑制劑(美國羅氏公司，批號：5892791001)；綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)抗體(武漢三鷹生物公司，批號：66002-1-Ig)；ECL化學(xué)發(fā)光液(美國Millipore公司，批號：WBKLS0100)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS;廠家：北京索萊寶生物公司，批號：P1010)。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建 以NKX2-5 cDNA作為模板設(shè)計引物(含BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點)，通過PCR法進(jìn)行NKX2-5基因擴(kuò)增，分別使用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物和PLVX-puro-MCS-GFP載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切，然后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并通過膠回收試劑盒純化NKX2-5基因擴(kuò)增產(chǎn)物和載體片段，通過T4連接酶將擴(kuò)增產(chǎn)物和載體片段進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)過夜后挑單菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，而后純化質(zhì)粒和測序鑒定，獲得pLVX-Puro-NKX2-5-GFP質(zhì)粒(NKX2-5質(zhì)粒)。以NKX2-5質(zhì)粒作為模板，采用點突變試劑盒將63位堿基序列由A突變?yōu)镚，獲得pLVX-Puro-NKX2-5 63A>G-GFP質(zhì)粒(NKX2-5 63A>G質(zhì)粒)。

1.3 慢病毒包裝 培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞并傳代，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，用適當(dāng)?shù)腄MEM培養(yǎng)基重懸后以1×104個/mL平鋪于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿上。將細(xì)胞置于含5% CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育8～24 h,當(dāng)細(xì)胞完全貼壁后將細(xì)胞分為GFP組、NKX2-5組和NKX2-5 63A>G組，并開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h換液(用10 mL完全培養(yǎng)基置換舊的培養(yǎng)基)；分別混勻3種待包裝質(zhì)粒[對照GFP空載質(zhì)粒(廠家：Addgene，批號：128652)、NKX2-5質(zhì)粒和NKX2-5 63A>G質(zhì)粒]，同時混勻病毒包裝體(psPAX2和病毒包膜(pMD2G)。取3個無菌1.5 mL EP管，分別依次加入400 μL無血清DMEM、1.500 g的待包裝質(zhì)粒、1.000 g的病毒包裝體(psPAX2)、0.500 g的病毒包膜(pMD2G)和6 μL Turbofect轉(zhuǎn)染試劑,即每個包裝體系中待包裝質(zhì)粒、病毒包裝體(psPAX2)、病毒包膜(pMD2G)的質(zhì)量比為3∶2∶1，充分混勻，靜置15～20 min后將混合液分別逐滴加入上述含有單層HEK293T細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕搖動細(xì)胞培養(yǎng)平皿后置于含5% CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。6～10 h后吸棄培養(yǎng)基，加入5 mL的37℃預(yù)熱完全培養(yǎng)基，繼續(xù)將細(xì)胞放置37℃、含5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，40 h后收集含慢病毒的上清(病毒液)進(jìn)行感染操作或者分裝后置于-80℃儲存待用。

1.4 細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)染 將P19細(xì)胞平鋪于6孔板，當(dāng)細(xì)胞達(dá)最佳密度30%～70%時，將細(xì)胞分為GFP組、NKX2-5組和NKX2-5 63A>G組，在6孔板中依次加入1 mL 1.3步驟獲得的相應(yīng)病毒液和終濃度為2 μg/mL的聚凝胺,充分搖勻后置于含5% CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，12～24 h后換液，采用熒光顯微鏡(明美光電公司，型號：MF41)觀察轉(zhuǎn)染效果，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)板后傳代或者用于后續(xù)試驗。

1.5 CCK-8實驗 取各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對數(shù)生長期P19細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，以每孔5 000個細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL，每組設(shè)3個平行孔并設(shè)不含細(xì)胞的空白對照(只有100 μL培養(yǎng)基)，置于含5% CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h后，將10 μL CCK-8試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0038)加入96孔板內(nèi)，37℃孵育1 h后，于酶標(biāo)儀490 nm波長處讀取吸光值，記錄結(jié)果。實驗重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞周期檢測 取各組對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對數(shù)生長期P19細(xì)胞，以1×104個/mL平鋪于細(xì)胞6孔板上，用DMEM培養(yǎng)，置于含5% CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行固定、透膜，然后采用周期試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C1052)染色，于流式細(xì)胞儀(貝克羅公司，型號：DxFLEX)上檢測細(xì)胞周期。實驗重復(fù)3次。

1.7 蛋白免疫印跡試驗 將各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對數(shù)生長期P19細(xì)胞棄除培養(yǎng)基后，用PBS洗滌3次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液后(在冰上操作)，用細(xì)胞刮刮凈細(xì)胞至1.5 mL離心管中再裂解30 min，將裂解產(chǎn)物離心后，測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后95℃煮沸5 min使蛋白變性，制作12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，加樣蛋白后進(jìn)行電泳，以100 V電壓濕轉(zhuǎn)100 min將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜；5%脫脂奶粉4℃封閉聚偏二氟乙烯膜過夜；棄去封閉液，PBST洗膜3次，5 min/次；將聚偏二氟乙烯膜按泳道剪切，放入4個干凈的培養(yǎng)皿中，分別加入GFP抗體(稀釋比例為1∶1 000)，并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH；稀釋比例為1∶3 000)蛋白(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：AF5009)作為內(nèi)參，室溫反應(yīng)2 h，PBST洗3次，5 min/次；加入1∶3 000稀釋的羊抗鼠辣根過氧化物酶-IgG(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：A0216)，室溫反應(yīng)1 h，PBST洗3次，5 min/次；ECL顯色并觀察記錄結(jié)果，通過Image J軟件進(jìn)行灰度分析。實驗重復(fù)3次。

1.8 實時定量PCR檢測 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的P19細(xì)胞，采用TRIzol法提取RNA，并通過NanoDrop核酸檢測儀測定RNA濃度及純度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo公司，批號：FSQ-101)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作，以cDNA為模板，SYBR熒光染料進(jìn)行實時定量PCR。反應(yīng)體系為：10 μL 2×qPCR Mix，1 μL cDNA模板，上下游引物各0.5 μL和8 μL雙蒸水。反應(yīng)條件為：95℃下預(yù)變性30 s，然后95℃變性5 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán),熱熔解階段95℃下變性60 s，56℃下熱熔解30 s，95℃熱熔解30 s。以GAPDH基因為內(nèi)參，檢測NKX2-5、GATA4、TBX5、心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、骨形成發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)、肌球蛋白輕鏈2V(myosin light chain 2V,MLC2V)、N-myc、心肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C(myocyte enhancer factor 2C, MEF2C)、蛻膜/心臟/自主神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)嵴衍生物表達(dá)蛋白2(deciduum,heart,autonomic nervous system,and neural crest derivatives-expressed protein 2,dHAND)和肌節(jié)同源異型框2(muscle segment homeobox 2,MSX2)的mRNA表達(dá)水平。引物序列見表1。目的基因的表達(dá)水平由實時定量PCR的CT值計算得出。實驗重復(fù)3次。

表1 待測基因引物序列

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用Tukey檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NKX2-5 63A>G質(zhì)粒的鑒定 構(gòu)建NKX2-5 63A>G質(zhì)粒后進(jìn)行測序，結(jié)果顯示在NKX2-5基因序列的第63位堿基由A突變?yōu)镚，表明點突變質(zhì)粒構(gòu)建成功。構(gòu)建NKX2-5 63A>G質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖1A，測序結(jié)果見圖1B。

圖1 NKX2-5 63A>G點突變載體

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞株的鑒定 將包裝好的GFP質(zhì)粒、NKX2-5質(zhì)粒和NKX2-5 63A>G質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞后，進(jìn)行嘌呤霉素篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒、NKX2-5質(zhì)粒和NKX2-5 63A>G質(zhì)粒的P19細(xì)胞株，均可表達(dá)出較強(qiáng)的熒光，見圖2A，提示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建成功。進(jìn)一步使用蛋白免疫印跡法檢測GFP抗體表達(dá)情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒的細(xì)胞在分子量為25 kDa左右的位置有明顯條帶；而轉(zhuǎn)染NKX2-5和NKX2-5 63A>G質(zhì)粒的細(xì)胞則在60 kDa左右有明顯條帶，提示存在NKX2-5和NKX2-5 63A>G蛋白表達(dá)，成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，見圖2B。

圖2 NKX2-5質(zhì)粒和NKX2-5 63A>G質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞株的鑒定結(jié)果

2.3 NKX2-5 63A>G突變對P19細(xì)胞增殖和周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，3組細(xì)胞周期比例差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，其中GFP組、NKX2-5 63A>G組、NKX2-5組G1期細(xì)胞比例依次升高，S期、G2期細(xì)胞比例依次降低(P<0.05)，見表2。CCK-8增殖實驗結(jié)果顯示，在0 h、24 h兩個時間點，3組細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但在48 h、72 h兩個時間點，3組細(xì)胞增殖能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中在48 h時NKX2-5 63A>G組吸光度值高于GFP組，在72 h時，GFP組吸光度值均高于其他兩組，且NKX2-5 63A>G組高于NKX2-5組(P<0.05)，見表3。

表2 3組P19細(xì)胞周期的比較(x±s，%)

表3 不同時間點3組P19細(xì)胞增殖情況的比較(x±s，吸光度值)

2.4 3組P19細(xì)胞NKX2-5、GATA4和TBX5 mRNA表達(dá)水平的比較 各組NKX2-5、GATA4和TBX5的mRNA相對表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 3組P19細(xì)胞NKX2-5、GATA4和TBX5 mRNA相對表達(dá)水平的比較(x±s)

2.5 3組P19細(xì)胞NKX2-5下游基因表達(dá)水平的比較 3組P19細(xì)胞的BMP4和MEF2C的mRNA表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與GFP組相比，NKX2-5組P19細(xì)胞的BMP4和MEF2C mRNA表達(dá)水平升高；與NKX2-5組比較，NKX2-5 63A>G組P19細(xì)胞的BMP4和MEF2C mRNA表達(dá)水平降低(均P<0.05)。3組P19細(xì)胞的ANF、MLC2V、N-myc、dHAND和MSX2 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表5。

表5 3組P19細(xì)胞ANP、BMP4、MLC2V、N-myc、MEF2C、dHAND和MSX2 mRNA相對表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

CHD的發(fā)病主要與環(huán)境因素和遺傳因素有關(guān)，多數(shù)是二者共同作用的結(jié)果。單純性CHD的發(fā)病主要與遺傳因素有關(guān)，占發(fā)病因素80%左右，主要包括染色體、單基因或多基因的異常。染色體異常因素包括染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)的異常，染色體結(jié)構(gòu)的異常又包括染色體大片段的倒轉(zhuǎn)、互置、缺失或重復(fù)，以及微小片段的缺失或拷貝數(shù)增加等。21-三體綜合征、Turner綜合征和22q11.1微缺失綜合征等是可引起CHD的常見染色體異常[9-11]。而在這些遺傳因素中，多基因遺傳約占90%，且這些基因之間相互作用，任何一個基因的質(zhì)量或數(shù)量發(fā)生異常都可能引起心臟發(fā)育異常，導(dǎo)致CHD的發(fā)生[12-13]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種可能與CHD發(fā)病有關(guān)的異?；?，而心臟早期發(fā)育過程的3個重要轉(zhuǎn)錄因子NKX2-5、GATA4和TBX5[4,14-16]被確認(rèn)與CHD有關(guān)，并且三者相互作用，共同調(diào)控心臟特異基因的表達(dá)[9-11]。

NKX2-5基因位于人類染色體5q35上，cDNA全長1 632 bp，編碼324個氨基酸，有2個外顯子，編碼4類高度保守的結(jié)構(gòu)域，是目前研究最多的與CHD發(fā)生有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。NKX2-5基因的缺失可導(dǎo)致胚胎死于心臟畸形，而其過表達(dá)可引起心臟擴(kuò)大[4-7]。一項針對我國人群的NKX2-5基因突變與CHD易感性之間關(guān)系的Meta分析結(jié)果顯示，該基因63A>G突變與CHD易感性有關(guān)[8,16]，但是NKX2-5 63A>G突變參與CHD發(fā)病的機(jī)制尚不清楚。本研究采用P19細(xì)胞研究NKX2-5 63A>G過表達(dá)對轉(zhuǎn)錄因子GATA4、TBX5、NKX2-5及其下游信號通路的影響，為闡明NKX2-5基因63A>G突變與CHD之間的關(guān)系奠定研究基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，NKX2-5基因過表達(dá)可以抑制P19細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，影響DNA的合成，但NKX2-5基因發(fā)生63A>G突變后，該抑制作用減弱；NKX2-5過表達(dá)能抑制P19細(xì)胞增殖，而NKX2-5 63A>G突變能部分減弱NKX2-5過表達(dá)對細(xì)胞增殖的抑制作用。這提示NKX2-5 63A>G突變可能影響 P19細(xì)胞的細(xì)胞周期和增殖。

有研究顯示，NKX2-5基因可通過影響下游基因，如ANP、BMP4、MLC2V、N-myc、MEF2C、dHAND和MSX2等基因的轉(zhuǎn)錄而參與心臟發(fā)育[8,17]。本研究結(jié)果顯示，NKX2-5 63A>G突變對心臟發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子GATA4和TBX5的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響，但可降低BMP和MEF2C mRNA的表達(dá)水平(均P<0.05)，提示NKX2-5 63A>G突變可通過影響NKX2-5下游部分基因的轉(zhuǎn)錄水平參與心臟發(fā)育異常的過程。

綜上所述，NKX2-5基因過表達(dá)可影響細(xì)胞周期，抑制P19細(xì)胞增殖，發(fā)生63A>G突變后抑制細(xì)胞增殖的作用減弱，機(jī)制可能與其影響NKX2-5下游部分基因的轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)。