沙中瑋 肖姝雲(yún) 錢春美 李 歐 張 潔 高圓媛 徐 建

(上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院1 神志病科，2 實驗中心，上海市 200071，電子郵箱：shazhongwei1989@163.com)

壓力應激是抑郁癥、焦慮癥發(fā)生發(fā)展的影響因素[1-2]，研究人員一直致力于建立一種高效度的模擬人類情緒應激狀態(tài)的動物模型，發(fā)現(xiàn)長期暴露于壓力環(huán)境下的嚙齒動物會出現(xiàn)焦慮、抑郁樣行為；慢性溫和不可預知應激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)模型是一種應用廣泛、有效且可靠的復合應激模型[3-4]，能夠誘導嚙齒動物產(chǎn)生焦慮、抑郁樣行為[5]。本研究通過CUMS誘導大鼠產(chǎn)生心理社會應激反應，觀察大鼠體質(zhì)量、行為學、外周血清促炎癥細胞因子及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)水平的變化，為進一步實驗研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級Wistar雄性大鼠12只，體質(zhì)量均為200 g左右，購于上海斯萊克實驗動物有限公司[動物生產(chǎn)許可：SCXK(滬)2017-0005，動物質(zhì)量合格證編號：2015000562560]，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院動物實驗中心[實驗動物使用許可證號：SYXK(滬)2014-0019]，每籠4只，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫(23±2)℃，濕度80%，12L/12D光照節(jié)律，適應性喂養(yǎng)7 d，其間自由飲水攝食。

1.1.2 主要試劑和儀器：大鼠曠場實驗箱(安徽正華生物儀器設備有限公司，尺寸：50 cm×50 cm×50 cm，型號：ZH-PS)；ZH-ZFT型自發(fā)活動實驗視頻分析系統(tǒng)(上海彤興生物科技有限公司)；大鼠高架十字迷宮視頻分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司，型號：PMT-100；高架十字迷宮尺寸：各臂臂長425 mm，寬度100 mm，高架高度500 mm，開臂臂高10 mm，閉臂臂高225 mm)；超純水機(HealForce公司，型號：NWVF-10)；洗板機(Labsystems Dragon公司，型號：4MK2)；微孔板孵化器(Bio-Rad公司，型號：237)；酶標儀(Labsystems Dragon公司，型號：MK3 353)；酶標系統(tǒng)(上海百基生物科技有限公司，型號：Varioscan Flash)；腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細胞介素(interleukin,IL)-6、BDNF酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(武漢博士德公司，批號：240141101108、133141051108、3714921108)。

1.2 實驗分組及CUMS模型的建立[1]將12只大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為空白組和模型組，各6只。適應性喂養(yǎng)7 d后，測量每只大鼠體質(zhì)量。空白組不給予任何處理，模型組進行為期28 d的CUMS刺激：給予禁水、禁食、潮濕墊料、籠傾斜45°、混籠、光周期變化、強迫游泳(水溫23.2℃)5 min等7種不可確定性輕度刺激，1次/d，按造模刺激時間表進行刺激，并于第28天CUMS刺激結(jié)束后，行為學實驗開始前測量每只大鼠體質(zhì)量。

1.3 行為學實驗

1.3.1 曠場實驗：于造模前、造模第14天和造模第28天后分別對每只大鼠進行曠場實驗。研究者持大鼠尾根1/3處將其輕輕放入曠場實驗箱底中央(底色為黑色)，立即蓋上嵌有攝像頭的實驗箱蓋子(底色為黑色)，攝像系統(tǒng)及ZH-ZFT型實驗視頻分析系統(tǒng)自動同步記錄大鼠5 min內(nèi)的行為變化，研究者根據(jù)監(jiān)測結(jié)果記錄大鼠總路程、中央活動路程和平均速度，每只大鼠測試1次。每只大鼠測試完畢，研究者用20%酒精擦拭箱底，再用干紗布擦凈。

1.3.2 高架十字迷宮實驗：造模第28天曠場實驗結(jié)束后，同日進行高架十字迷宮實驗。測試前，將大鼠提前5 min單獨放置在一個白色塑料箱(60 cm×60 cm×35 cm)中適應新環(huán)境5 min，隨后將大鼠輕輕放置于高架十字迷宮的中央，使其頭部朝向開臂區(qū)，釋放大鼠后通過攝像系統(tǒng)及PMT-100十字迷宮視頻分析軟件同步記錄大鼠5 min內(nèi)的開放臂區(qū)進入次數(shù)、開臂區(qū)滯留時間、閉臂區(qū)進入次數(shù)、閉臂區(qū)滯留時間、中央?yún)^(qū)進入次數(shù)、中央?yún)^(qū)滯留時間等相關參數(shù)，總時間=開臂區(qū)滯留時間+閉臂區(qū)滯留時間+中央?yún)^(qū)滯留時間，總次數(shù)=開臂區(qū)進入次數(shù)+閉臂區(qū)進入次數(shù)。計算焦慮指數(shù)[6-7]。焦慮指數(shù)值在0～1范圍內(nèi)，焦慮指數(shù)越高表示類似焦慮的行為越頻繁。

1.4 ELISA法檢測大鼠外周血清TNF-α、IL-6及BDNF水平 在造模第28天行為學實驗結(jié)束后，立即將大鼠麻醉后抽取腹主動脈血3～5 mL，室溫凝固2 h或4℃過夜，3 000 r/min離心10 min，收集血清置于-80℃冷藏待測。采用ELISA試劑盒分別檢測血清TNF-α、IL-6、BDNF水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布的計量資料以[M(P25，P75)]表示，比較采用秩和檢驗。重復測量計量資料的比較采用重復測量方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠造模前后體質(zhì)量的比較 造模前兩組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造模第28天后，模型組大鼠體質(zhì)量輕于空白組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠造模前后體質(zhì)量的比較(x±s，g)

2.2 兩組大鼠曠場實驗結(jié)果的比較 經(jīng)球形檢驗，兩組曠場實驗總路程數(shù)據(jù)符合球形假設(P=0.083)。主體間效應方差分析檢驗顯示，兩組大鼠總路程比較，差異無統(tǒng)計學意義(F組間=0.928，P組間=0.358)，兩組總路程均有隨時間的延長而下降的趨勢(F時間=35.237，P時間<0.001)，分組與時間不存在交互效應(F交互=2.098，P交互=0.149)。見表2。

經(jīng)球形檢驗，兩組曠場實驗中央活動路程數(shù)據(jù)符合球形性假設(P=0.295)。主體內(nèi)效應檢驗顯示，兩組大鼠中央活動路程比較，差異無統(tǒng)計學意義(F組間=1.913，P組間=0.197)，兩組中央路程均有隨時間變化的趨勢(F時間=4.014，P時間=0.034)，其中，兩組中央活動路程從造模開始至造模第14天呈現(xiàn)上升的趨勢，造模第14天開始至造模第28天呈現(xiàn)明顯下降趨勢。分組與時間不存在交互作用(F交互=1.359，P交互=0.280)。但造模第28天，模型組中央活動路程短于空白組(P<0.05)。見表2。

經(jīng)球形檢驗，兩組曠場實驗平均速度數(shù)據(jù)滿足球形性假設(P=0.083)。主體間效應檢驗顯示，兩組大鼠平均速度比較，差異無統(tǒng)計學意義(F組間=0.933，P組間=0.357)，兩組平均速度均有隨著時間的延長而下降的趨勢(F時間=35.232，P時間<0.001)，分組與時間不存在交互效應(F交互=2.099，P交互=0.149)。見表2。

表2 兩組大鼠曠場實驗總路程結(jié)果比較(x±s)

2.3 兩組大鼠高架十字迷宮實驗結(jié)果的比較 模型組大鼠的開臂區(qū)滯留時間短于空白組(P<0.05)，而兩組大鼠開臂區(qū)運動距離、開臂區(qū)進入次數(shù)、開臂/在臂進入次數(shù)百分比、開臂/在臂滯留時間百分比比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。兩組大鼠的閉臂區(qū)滯留時間、閉臂區(qū)運動距離、閉臂區(qū)進入次數(shù)、閉臂/在臂進入次數(shù)百分比、閉臂/在臂滯留時間百分比比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。兩組大鼠的中央?yún)^(qū)滯留時間、中央?yún)^(qū)運動距離、中央?yún)^(qū)進入次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5。造模第28天，模型組、空白組的焦慮指數(shù)分別為(0.87±0.05)%、(0.78±0.07)%，模型組焦慮指數(shù)高于空白組(t=-2.563，P=0.028)。

表3 兩組大鼠高架十字迷宮開臂區(qū)行為學的比較

表4 兩組大鼠高架十字迷宮閉臂區(qū)行為學的比較

表5 兩組大鼠高架十字迷宮中央?yún)^(qū)行為學的比較(x±s)

2.4 兩組大鼠外周血清TNF-α、IL-6、BDNF水平的比較 兩組大鼠血清TNF-α水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組大鼠血清IL-6水平高于空白組，但BDNF水平低于空白組(P<0.05)。見表6。

表6 兩組大鼠外周血清TNF-α、IL-6及BDNF水平的比較(x±s，pg/mL)

3 討 論

隨著我國經(jīng)濟社會的快速轉(zhuǎn)型、生活節(jié)奏的加快，每個人都頂著多重身份和角色，壓力或應激充斥著每個人的生活和工作，心理健康問題日益凸顯，其已成為備受關注的精神心理公共衛(wèi)生問題。長期暴露在情緒應激的壓力環(huán)境下，人們的行為會產(chǎn)生病理性改變。本研究通過構(gòu)建CUMS大鼠模型模擬人類的情緒應激反應，觀察CUMS對大鼠行為學、外周血清促炎癥因子及BDNF水平的影響。

曠場實驗通常被用于測定嚙齒動物的運動功能和情緒[8]，具有操作簡單、可行性良好等特點，能夠通過記錄總活動路程、中央活動路程等指標評價大鼠的不同行為變化。曠場實驗中央?yún)^(qū)活動反映了嚙齒動物對新奇環(huán)境的探索行為[9]。但研究顯示，疲勞或抑郁的大鼠自主運動能力下降，更喜歡在箱子的邊緣區(qū)域活動，且其總活動路程會減少[10]。本研究結(jié)果顯示，造模第28天，模型組中央活動路程短于空白組(P<0.05)，而造模前、造模第14天、造模第28天兩組大鼠的總路程和平均速度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示造模第28天大鼠在曠場實驗中存在一定的探索矛盾心理，造模前和造模14 d時焦慮水平不明顯。

高架十字迷宮通過記錄嚙齒動物在開臂區(qū)和閉臂區(qū)的滯留時間、進入次數(shù)來評價焦慮樣行為，被廣泛應用于嚙齒動物焦慮行為的評估，并常用于抗焦慮藥物的篩選[11]。開臂區(qū)相關行為學指標反映焦慮行為的變化，本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的開臂區(qū)滯留時間短于空白組(P<0.05)，而兩組大鼠開臂區(qū)運動距離、開臂區(qū)進入次數(shù)、開臂/在臂進入次數(shù)百分比、開臂/在臂滯留時間百分比比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示CUMS大鼠趨于避開開臂區(qū)，表現(xiàn)出一定的焦慮樣行為。閉臂區(qū)相關行為學指標主要反映自主活動變化中央?yún)^(qū)域是開臂與閉臂的交叉區(qū)域，主要用于測試開始時動物選擇活動區(qū)域以及計算總時間，本研究結(jié)果顯示，造模第28天兩組大鼠的閉臂區(qū)滯留時間、閉臂區(qū)運動距離、閉臂區(qū)進入次數(shù)、閉臂/在臂進入次數(shù)百分比和閉臂/在臂滯留時間百分比以及中央?yún)^(qū)滯留時間、中央?yún)^(qū)進入次數(shù)、中央?yún)^(qū)運動距離比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，與空白組比較，造模第28天模型組大鼠的體質(zhì)量降低，焦慮指數(shù)升高(P<0.05)，提示持續(xù)28 d的CUMS能夠使大鼠體質(zhì)量下降，誘導大鼠產(chǎn)生焦慮樣行為。

研究證明，慢性應激能夠下調(diào)BDNF的表達[12]，促進炎癥反應[13]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清IL-6水平高于空白組，BDNF水平低于空白組(均P<0.05)，但兩組大鼠的TNF-α水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示CUMS可以誘導大鼠外周血清BDNF水平降低，促進促炎癥細胞因子IL-6的釋放。這與既往研究結(jié)果相似[14-16]。說明CUMS誘導焦慮樣行為的發(fā)生機制可能與促炎癥因子的釋放、BDNF的減少有關。

綜上所述，CUMS能夠誘導大鼠產(chǎn)生焦慮樣行為，使大鼠體質(zhì)量下降，促進IL-6釋放，降低血清中BDNF水平。雖然焦慮的確切機制尚不清楚，但可能與促炎癥細胞因子介導的炎癥反應、BDNF的減少導致疾病條件下神經(jīng)元受損有關[17]。