齊新剛 顧永欣 肖 云 杜 雷

(1 中國人民解放軍新疆軍區(qū)總醫(yī)院北京路醫(yī)療區(qū)全軍眼科中心，烏魯木齊市 830013，電子郵箱：qx98210@163.com；2 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊市 830011)

視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)是眼科視網(wǎng)膜疾病中一種較為常見的病理過程，主要發(fā)生在青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和視網(wǎng)膜血管疾病等有關(guān)疾病中，RIRI是導(dǎo)致視力障礙或失明的主要原因[1-2]。研究表明，RIRI可能與眾多因素密切相關(guān)，例如氧自由基損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣超載及細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致視功能障礙[3]。因此，有必要探討其有效的防治措施。

瞬時(shí)感受器電位香草素受體亞家族Ⅳ型(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是一種在生物體內(nèi)普遍表達(dá)的非選擇性陽離子通道，作為瞬時(shí)感受器電位(transient receptor potential,TRP)通道家族成員之一，TRPV4通道可被包括低滲、溫度、pH和戶外紫外線輻射等一系列刺激所激活[4]。目前，已有研究證明TRPV4參與調(diào)節(jié)多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑和病理生理過程，例如TRPV4通道拮抗劑HC-067047可在口腔、內(nèi)臟和神經(jīng)性疼痛疾病中起到鎮(zhèn)痛作用[5]，并具有減輕肺損傷和神經(jīng)元損傷的作用[6-7]。本研究探討TRPV4通道拮抗劑HC-067047對RIRI后視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡和新生血管形成的作用，以期進(jìn)一步闡明其在RIRI中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔級雄性SD大鼠30只，4周齡，體質(zhì)量 180～220 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號：SCXK(新)2018-0002]。主要試劑：TRPV4抑制劑HC-067047(英國Abcam公司，批號：ab145868)，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(北京百奧萊博公司，批號：YT165)，脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)凋亡檢測試劑盒與免疫組化試劑盒(北京中杉生物公司，批號：ZK8005、ZK9600)，TRIzol試劑(美國Invitrogen公司，批號：15596-018)、Prime ScriptTMRT試劑盒與SYBR Premix Ex TaqTMPCR試劑盒(日本TaKaRa公司，批號：RR047A、RR420A)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解緩沖液與ECL化學(xué)發(fā)光液(上海碧云天生物研究所，批號：P0012S、P0013C、P0018S)，兔抗大鼠血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體(美國Santa Cruz公司，批號：SC-7269、SC-390172、SC-33673)，兔抗大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(美國Abcam 公司，批號：ab32351、ab32124、ab182733、ab181602、ab205718)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠RIRI模型的建立：采用大鼠眼球前房內(nèi)灌注生理鹽水法建立大鼠RIRI模型[8]。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg/kg)全身麻醉后，將大鼠側(cè)臥位放置并固定在固定板上，在右眼球上滴加托吡卡胺滴眼液。使用27 G針頭連接生理鹽水輸液袋，打開輸液袋閥門通道，將針尖自大鼠右眼虹膜邊緣緩緩刺入前房，待前房充入生理鹽水脹大后繼續(xù)進(jìn)針，以與右眼虹膜呈45°夾角進(jìn)針刺破角膜，操作過程中避免損傷虹膜與晶狀體，固定針頭方向，并緩慢松開輸液袋導(dǎo)管夾，使前房內(nèi)壓力達(dá)到 110 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。采用檢眼鏡觀察大鼠眼睛，見眼底蒼白、水腫且前房變深即為造模成功。持續(xù)60 min后關(guān)閉輸液閥門通道，拔出針頭，在眼球表面涂抹紅霉素眼膏防止眼球感染。

1.2.2 大鼠分組、給藥及處理：采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只SD大鼠分為3組：對照組、RIRI組和RIRI+HC-067047組，每組10只。RIRI組和RIRI+HC-067047組大鼠按照1.2.1的方法進(jìn)行RIRI造模，RIRI+HC-067047組大鼠分別在造模后5 h、10 h通過側(cè)腦室注射HC-067047(5 μmol/μL)2 μL，對照組和RIRI組大鼠同時(shí)給予同等劑量的生理鹽水。分別記錄3組大鼠在治療后第7天、第14天與第21天的體質(zhì)量。造模與治療過程中無大鼠死亡。在飼養(yǎng)第 21 天時(shí)處死所有大鼠，迅速取出大鼠右眼球視網(wǎng)膜組織，一部分置于4%多聚甲醛液中固定，一部分在液氮中冷凍后保存于-80℃冰箱。

1.2.3 HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化：取出固定于4%多聚甲醛液中的各組大鼠視網(wǎng)膜組織，磷酸緩沖鹽溶液沖洗后使用梯度酒精脫水，石蠟包埋，并切成厚度約為4 μm的薄片，脫蠟至水后，蘇木精染色5 min，流水沖洗3次，5 min/次，伊紅染色液染色3 min，經(jīng)酒精脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片，在WMS-1033光學(xué)顯微鏡(上海豫光儀器)200倍下觀察圖像并拍照分析。

1.2.4 TUNEL染色檢測大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡情況：將大鼠視網(wǎng)膜組織石蠟切片置于60℃下烤片2 h脫蠟，加入20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K，室溫孵育30 min，然后加入50 μL TUNEL檢測液，在37℃下孵育1 h，再加入50 mL過氧化物酶轉(zhuǎn)化劑37℃孵育30 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，5 min/次，滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染液(博士德生物工程有限公司，批號：AR1177)，室溫避光孵育10 min，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)高倍(×100)視野，計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比為凋亡指數(shù)。TUNEL染色陽性表現(xiàn)為視網(wǎng)膜組織陽性凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核固縮，染色呈綠色。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色檢測Caspase-3、VEGF蛋白陽性表達(dá)情況：將大鼠視網(wǎng)膜組織石蠟切片脫蠟至水，將檸檬酸鈉修復(fù)液稀釋50倍，取50 mL加熱至95℃，浸入切片進(jìn)行組織抗原修復(fù)，3% H2O2中孵育10 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，將山羊血清封閉原液用磷酸緩沖鹽溶液稀釋，配制成10%工作液，直接滴在組織切片上，在37℃下孵育1 h，滴加兔抗大鼠Caspase-3(1∶1 000)、VEGF(1∶500)4℃孵育過夜。次日，采用磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次，5 min/次，在室溫下與辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(美國EarthOx公司，批號：E030100)孵育1 h。用磷酸緩沖鹽溶液再次沖洗3次，5 min/次，滴加二氨基聯(lián)苯胺染色，蘇木精復(fù)染，使用二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察圖像，陽性細(xì)胞呈褐色至棕褐色，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍(×100)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，陽性率為陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、核因子E2相關(guān)因子2、缺氧誘導(dǎo)因子1-α mRNA的表達(dá)水平：使用TRIzol試劑提取大鼠視網(wǎng)膜組織總RNA。通過Prime ScriptTMRT試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為底物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增，根據(jù)SYBR Premix ExTaqTMPCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。PCR擴(kuò)增體系為cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，無酶水8.5 μL。擴(kuò)增條件為95℃，10 min；在以下參數(shù)下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min。各基因引物序列由上海生工生物有限公司合成。引物序列如下：VEGF上游引物：5′-GGCGAGGCAGCTTGAGTTAC-3′，下游引物：5′-CTGTCGACGGTGACGATGGT-3′；核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)上游引物：5′-CCTTCCTCTGCTGCCATTAGT-3′，下游引物：5′-CCTTCCTCTGCTGCCATTAGT-3′；缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)上游引物：5′-CGCGAACGACAAGAAAAAGGC-3′，下游引物：5′-CGTATATAAAGATGCGAACTCAC-3′；GAPDH上游引物：5′-GTATGACTCCACTCACGGCA-3′，下游引物：5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGT-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA的相對表達(dá)水平。

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織中PEDF、GFAP、Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)水平：取出在液氮中冷凍后置于-80℃冰箱保存的大鼠視網(wǎng)膜組織，剪碎后加入RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白，使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。以50 μg蛋白加樣后，通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜3次，5 min/次。加入稀釋后的兔抗大鼠PEDF(1∶5 000)、GFAP(1∶5 000)、Caspase-3(1∶5 000)、Bax(1∶5 000)及Bcl-2(1∶5 000)為一抗，以GAPDH為內(nèi)參，4℃下孵育過夜。TBST洗膜3次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，5 min/次，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量的比較 實(shí)驗(yàn)前以及治療后第7、14天，三組的大鼠體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；治療后第21天，RIRI組大鼠體質(zhì)量低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量的比較(x±s，g)

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜病理組織學(xué)觀察 對照組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)清楚、各層細(xì)胞排列整齊；RIRI組大鼠視網(wǎng)膜組織各層細(xì)胞排列雜亂；RIRI+HC-067047組大鼠視網(wǎng)膜厚度增加，視網(wǎng)膜內(nèi)各層細(xì)胞排列趨于規(guī)則。見圖1。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜病理組織學(xué)圖像(HE染色，×200)

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 對照組大鼠視網(wǎng)膜幾乎無TUNEL陽性細(xì)胞，RIRI組大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)較多TUNEL陽性細(xì)胞，RIRI+HC-067047組大鼠視網(wǎng)膜有少量TUNEL陽性細(xì)胞，見圖2。RIRI組和RIRI+HC-067047組細(xì)胞凋亡指數(shù)均高于對照組，但RIRI+HC-067047組細(xì)胞凋亡指數(shù)低于RIRI組(P<0.05)，見表2。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色，×100)

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-3、VEGF蛋白陽性表達(dá)情況 RIRI組和RIRI+HC-067047組大鼠視網(wǎng)膜組織中Caspase-3、VEGF蛋白陽性表達(dá)率均高于對照組，但RIRI+HC-067047組的Caspase-3、VEGF蛋白陽性表達(dá)率低于RIRI組(P<0.05)。見表2、圖3、圖4。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)、Caspase-3與VEGF蛋白陽性表達(dá)情況的比較(x±s)

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-3表達(dá)檢測(免疫組織化學(xué)染色，×100)

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF表達(dá)檢測(免疫組織化學(xué)染色，×100)

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、VEGF、HIF-1α mRNA相對表達(dá)水平的比較 RIRI組和RIRI+HC-067047組大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、VEGF、HIF-1α mRNA相對表達(dá)水平均高于對照組，而RIRI+HC-067047組大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、VEGF、HIF-1α mRNA相對表達(dá)水平低于RIRI組(P<0.05)，見表3。

表3 3組大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、VEGF、HIF-1α mRNA相對表達(dá)水平的比較(x±s)

2.6 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中PEDF、GFAP、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的比較 RIRI組和RIRI+HC-067047組大鼠視網(wǎng)膜組織中PEDF、Bcl-2蛋白表達(dá)水平較對照組下降，GFAP、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平較對照組升高(P<0.05)；與RIRI組比較，RIRI+HC-067047組中PEDF、Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，GFAP、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)，見圖5與表4。

圖5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中PEDF、GFAP、Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)檢測

表4 3組大鼠視網(wǎng)膜組織中PEDF、GFAP、Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

RIRI是常見的眼科臨床疾病，主要發(fā)生在視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)。視網(wǎng)膜缺血是由于視網(wǎng)膜血液供應(yīng)減少而導(dǎo)致氧氣和其他營養(yǎng)元素向視網(wǎng)膜內(nèi)部層輸送減少所致，缺血后血液的再灌注與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[9-10]。RIRI可引起神經(jīng)元損失、視網(wǎng)膜形態(tài)變性以及視網(wǎng)膜功能的喪失，最終將會導(dǎo)致失明。急性高眼壓時(shí)視網(wǎng)膜氧分壓降低，且缺血缺氧會導(dǎo)致視網(wǎng)膜病理學(xué)改變與一系列的代謝障礙[11]。本研究運(yùn)用前房生理鹽水灌注法來構(gòu)建大鼠RIRI模型，觀察發(fā)現(xiàn)RIRI組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化，各層細(xì)胞排列雜亂，且視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層較正常大鼠變薄。此外，體質(zhì)量可反映或長或短時(shí)間內(nèi)營養(yǎng)狀況的變化，它能評價(jià)體內(nèi)的營養(yǎng)情況，尤其是放映能量的攝取與消耗是否平衡以及脂肪在體內(nèi)的增加或減少的一個(gè)重要指標(biāo)，也是反映疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，治療后第21天，RIRI大鼠的體質(zhì)量較對照大鼠降低，提示大鼠體內(nèi)出現(xiàn)了病變。

TRP通路包含大量陽離子通道，大部分可滲透Ca2+，類香草素受體為TRP亞家族之一，由TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5和TRPV6組成[12]。已有研究表明，TRPV4通道激活可引起Ca2+內(nèi)流，在腦缺血再灌注損傷中具有至關(guān)重要的作用[13]。在本研究中，給予RIRI大鼠TRPV4抑制劑HC067047干預(yù)后，大鼠視網(wǎng)膜組織病理變化明顯減輕，推測抑制TRPV4通道可能可以減輕 RIRI大鼠視網(wǎng)膜損傷。

RIRI引起代謝紊亂、能量消耗和一系列后續(xù)反應(yīng)，例如自由基產(chǎn)生、線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)、鈣蛋白酶和半胱天冬酶的活化，導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡[14]。作為細(xì)胞凋亡的經(jīng)典途徑，Caspase-3是Caspases的主要效應(yīng)物，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白。本研究結(jié)果顯示，治療后第21天，RIRI大鼠視網(wǎng)膜中TUNEL 陽性細(xì)胞增加，促凋亡蛋白Caspase-3和Bax表達(dá)增加，而抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少(P<0.05)。經(jīng)過HC067047干預(yù)后，RIRI大鼠視網(wǎng)膜中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，Caspase-3和Bax表達(dá)減少，Bcl-2表達(dá)增加(P<0.05)。說明抑制TRPV4通道可減少RIRI大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)視網(wǎng)膜的作用。

血管新生是一個(gè)多因子參與的復(fù)雜生理與病理過程，涉及多個(gè)信號通路之間的相互作用。在RIRI過程中，血管網(wǎng)向外不斷延伸，血管通透性改變，導(dǎo)致血漿發(fā)生滲漏，玻璃體后皮質(zhì)與視網(wǎng)膜分離，對視覺功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響[15]。因此，視網(wǎng)膜新生血管形成是RIRI損傷的重要表現(xiàn)。VEGF和PEDF分別具有促進(jìn)新生血管形成和抑制新生血管形成的作用[16]，兩者表達(dá)平衡對RIRI至關(guān)重要。GFAP 為中間絲骨架蛋白，對視網(wǎng)膜細(xì)胞膠質(zhì)增殖起到重要作用[17]。而Nrf2可通過介導(dǎo)下游一系列抗氧化物的合成和表達(dá)來調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化平衡，HIF-1α不僅可以通過介導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子來適應(yīng)機(jī)體組織的缺氧，還可以通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)來促進(jìn)新生血管形成[18]。與RIRI組大鼠比較，經(jīng)過HC067047干預(yù)后，RIRI大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF細(xì)胞陽性率下降，Nrf2、VEGF、HIF-1α的mRNA相對表達(dá)水平下降，同時(shí)PEDF蛋白表達(dá)水平升高而GFAP蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)。由此推斷，抑制TRPV4通道可抑制RIRI大鼠視網(wǎng)膜新生血管的形成。

綜上所述，抑制TRPV4通道能夠減少視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，并且可以抑制視網(wǎng)膜新生血管的形成，從而對RIRI大鼠視網(wǎng)膜損傷發(fā)揮保護(hù)作用。但RIRI 病理機(jī)制復(fù)雜，HC-067047的應(yīng)用是否存在副作用仍需深入研究探討。