譚素紅 梅習(xí)平 丁惠娟 李 媛

(1 湖南省人民醫(yī)院麻醉醫(yī)學(xué)中心，長沙市 410002，電子郵箱：mge2345@163.com；2 湖南省腫瘤醫(yī)院/中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，長沙市 410002)

術(shù)后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)多發(fā)于急診手術(shù)或大手術(shù)后的老年患者，是術(shù)后臨床常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，表現(xiàn)為意識紊亂、焦慮、人格改變、注意力及記憶力減退等，影響患者術(shù)后的生活質(zhì)量。POCD與年齡、手術(shù)、麻醉等多種因素有關(guān)，且?guī)缀跛蠵OCD的發(fā)生都與年齡相關(guān)[1]。老年人中樞神經(jīng)功能減退，手術(shù)創(chuàng)傷極易損傷神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致POCD發(fā)生。近年來，手術(shù)操作和麻醉技術(shù)的進步，在一定程度上緩解了POCD的發(fā)生，但隨著人口老齡化發(fā)展，接受手術(shù)治療的老年患者比例不斷增加，POCD發(fā)生率仍居高不下，因此尋找有效方法保護老年患者的腦神經(jīng)至關(guān)重要。經(jīng)皮穴位電刺激(transcutaneous electrical acupoint stimulation，TEAS)療法是一種新型物理治療方法，其將電神經(jīng)療法與中醫(yī)針灸穴位相結(jié)合，并以中醫(yī)經(jīng)絡(luò)腧穴理論為指導(dǎo)，通過穴位將低頻脈沖電流輸入，在進行穴位刺激的同時施行低頻電療，以達到治療疾病的目的[2]。研究顯示，TEAS與傳統(tǒng)針灸功能相似，具有平衡麻醉的作用，并在腦卒中等神經(jīng)性疾病中有明顯的輔助或替代治療的效果[3-4]。但TEAS對POCD患者的腦保護作用及可能機制的相關(guān)研究較少，本研究通過建立POCD大鼠模型，探討TEAS的腦保護作用及其可能機制，旨在為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠，雄性，45只，18月齡，體質(zhì)量500～650 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]提供，均無明顯運動障礙。于溫度為21℃～25℃、相對濕度為50%～70%、12 h明暗交替、清潔通風(fēng)的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，動物自由采食飲水。

1.2 主要試劑和儀器 石杉堿甲片(國藥準字H20093133，規(guī)格：0.05 mg×24 s)購自辰欣藥業(yè)股份有限公司，脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)凋亡染色試劑盒(批號：C1091)購自碧云天生物工程有限公司，RIPA裂解液(批號：R0020-100)購自北京索萊寶科技有限公司，腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)α多抗(批號：ab110036)、磷酸化AMPKα(phosphorylated AMPKα,p-AMPKα)單抗(批號：ab133448)、Beclin1單抗(批號：ab210498)、液泡分選蛋白34(vacuolar protein sorting 34，Vps34)單抗(批號：ab240006)、β-肌動蛋白(β-actin)單抗(批號：ab8226)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(批號：ab6721)購自美國Abcam公司、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)多抗(包含LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ 兩種抗體；批號：VB2932)購自英國Viva Bioscience公司。韓氏穴位神經(jīng)刺激儀購自北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司，Morris水迷宮系統(tǒng)購自安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司，H-7500透射電子顯微鏡購自日本Hitachi Limited公司，垂直電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 建模、分組及干預(yù)：采用隨機數(shù)字表法抽取35只大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg，溶于5 mL生理鹽水)進行麻醉，固定于手術(shù)臺上，腹部備皮消毒，鋪手術(shù)巾，于上腹部腹正中線作一約5 cm的切口，鈍性分離肌肉，暴露腹膜，剪開后使用探查針依次探查肝、脾、胃、小腸和大腸，約2 min；還納腸管，游離脾臟至術(shù)野中央，用1號絲線將脾門血管雙重結(jié)扎，行脾切除術(shù)(如有副脾，需一并切除)，3-0號線縫合傷口，使用0.25%丁哌卡因浸潤傷口鎮(zhèn)痛。術(shù)后腹腔注射青霉素40萬U，1次/d，連續(xù)3 d，單籠飼養(yǎng)。選取術(shù)后24 h無行動障礙的30只大鼠進行后續(xù)實驗，采用隨機數(shù)字表法分為手術(shù)組、TEAS組、西藥組，每組各10只。另取10只大鼠為對照組，腹腔注射5 mL生理鹽水，不行腹部手術(shù)。術(shù)后24 h進行干預(yù)。(1)TEAS組。固定大鼠，根據(jù)《實驗針灸學(xué)》[5]，選取頭頂百會、神庭和兩前肢內(nèi)關(guān)、合谷和后肢三陰交、足三里，給予TEAS，頻率15 Hz，強度10 mA，共刺激30 min，同時灌胃5 mL生理鹽水。(2)對照組和手術(shù)組。為確保實驗條件一致，兩組均給予假穴位電刺激(避開特定穴位，即穴位右側(cè)1 cm處)，頻率15 Hz，強度10 mA，刺激30 min，并灌胃5 mL生理鹽水。(3)西藥組。固定大鼠，給予假穴位電刺激(避開特定穴位，即穴位右側(cè)1 cm處)，刺激頻率、強度和時間同TEAS組，同時灌胃石杉堿(溶于5 mL生理鹽水)3 mg/kg。各組干預(yù)均1次/d，連續(xù)1周。

1.3.2 Morris水迷宮實驗：末次治療后12 h，進行水迷宮實驗檢測大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮系統(tǒng)包括水池和錄像系統(tǒng)，水池直徑150 cm，高30 cm，水溫23℃～25℃，分為4個象限(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，每個象限設(shè)有固定入水點，Ⅳ象限水面下2 cm處設(shè)一平臺(直徑10 cm)。(1)定位航行試驗。將大鼠隨機從4個入水點放入水中，觀察大鼠找到水下平臺所需時間，即逃避潛伏期，如120 s內(nèi)找不到平臺，則引導(dǎo)其到平臺停留30 s，每天進行3次訓(xùn)練，連續(xù)訓(xùn)練5 d，記錄第6天各組大鼠的逃避潛伏期。(2)空間探索實驗。第6天撤去平臺，記錄大鼠入水找到原平臺象限后的停留時間及穿越原平臺次數(shù)。

1.3.3 曠場實驗：水迷宮實驗結(jié)束后，進行曠場實驗檢測大鼠行為學(xué)。曠場箱底部為50 cm×50 cm的正方形，高40 cm，上方安裝攝像頭，底部劃分為25個相等的正方形。將大鼠放入曠場中央，檢測5 min內(nèi)大鼠水平運動得分(以跨過方格次數(shù)計分，跨過1格為1分)和垂直運動得分(以站立次數(shù)計分，站立1次為1分)。每只大鼠測試完畢后使用70%乙醇擦拭曠場四周和底部，以免大鼠氣味影響后續(xù)實驗的大鼠。

1.3.4 蘇木精-伊紅染色觀察腦組織病理變化：曠場實驗結(jié)束后，采用隨機數(shù)字表法，各組抽取5只大鼠，開胸，暴露心臟，行左心室-升主動脈灌注，先用預(yù)溫生理鹽水灌注，待右心房流出清澈液體，改用4%多聚甲醛灌注，待大鼠出現(xiàn)四肢抽搐，全身僵硬，停止灌注。取腦，分離海馬，固定于4%多聚甲醛中。乙醇脫水，二甲苯透明，制作石蠟切片(厚約4 μm)，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織病理學(xué)變化。

1.3.5 TUNEL染色觀察神經(jīng)元細胞凋亡：取石蠟片，二甲苯脫蠟，乙醇脫水，蛋白酶K 37℃作用30 min，磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，滴加TUNEL檢測液37℃避光孵育60 min，磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，封片，顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，棕色的細胞為凋亡細胞，每張切片于400倍鏡下計數(shù)5個視野的凋亡細胞數(shù)，計算凋亡率(%)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%，取均值。

1.3.6 透射電鏡觀察海馬組織自噬情況：處死各組剩余大鼠，取腦分離海馬組織，部分海馬組織保存于液氮中，剩余海馬用磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mmol/L)清洗3次，2.5%戊二醛固定2 h，1%四氧化鋨固定2 h，磷酸鹽緩沖溶液清洗3次，常規(guī)乙醇、丙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸透、包埋，制備切片(厚度約0.5 μm)，光鏡下定位海馬區(qū)，制備60 μm超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，透視電鏡(日本日立公司，型號：H-7500)下觀察并拍照。

1.3.7 蛋白免疫組化法檢測海馬組織相關(guān)蛋白表達：取保存于液氮的海馬組織，加入RIPA裂解液提取總蛋白，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。取等量蛋白上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，放入5%脫脂牛奶中4℃封閉2 h，TBST溶液洗膜，加入1 ∶1 000稀釋的AMPKα、p-AMPKα、Beclin1、Vps34、LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ、β-actin一抗，4℃孵育過夜，TBST溶液洗膜，加入1 ∶4 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，常溫孵育2 h，加入ECL發(fā)光液，顯影曝光。采用Image J 軟件分析圖像，以β-actin為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達量(即目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值)，并計算LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白相對表達量的比值(即LC3-Ⅱ蛋白相對表達量/LC3-Ⅰ蛋白相對表達量)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力指標的比較 4組的逃避潛伏期、原平臺象限停留時間、穿越平臺次數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與對照組比較，手術(shù)組、TEAS組、西藥組逃避潛伏期延長，原平臺象限停留時間縮短，穿越平臺次數(shù)減少(均P<0.05)；與手術(shù)組比較，TEAS組、西藥組逃避潛伏期縮短，原平臺象限停留時間延長，穿越平臺次數(shù)增加(均P<0.05)；但TEAS組與西藥組以上指標比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 4組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力指標的比較(x±s)

2.2 各組大鼠行為學(xué)指標的比較 4組的水平運動得分和垂直運動得分差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與對照組比較，手術(shù)組、TEAS組、西藥組水平運動得分、垂直運動得分均減少(均P<0.05)；與手術(shù)組比較，TEAS組、西藥組水平運動得分、垂直運動得分均增加(均P<0.05)；TEAS組與西藥組水平運動得分、垂直運動得分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 4組大鼠行為學(xué)指標的比較(x±s，分)

2.3 各組海馬組織病理學(xué)變化 顯微鏡下觀察，對照組大鼠海馬組織神經(jīng)元細胞形態(tài)正常，排列整齊，大小及核染色均勻；手術(shù)組海馬組織神經(jīng)元細胞形態(tài)改變，核固縮，部分細胞出現(xiàn)壞死；TEAS組和西藥組海馬組織神經(jīng)元細胞形態(tài)較正常，核固縮減少，壞死細胞減少，較手術(shù)組改善明顯。見圖1。

圖1 海馬組織病理學(xué)變化(HE染色，×400)

2.4 各組海馬神經(jīng)元細胞凋亡率的比較 各組海馬神經(jīng)元細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，手術(shù)組、TEAS組、西藥組神經(jīng)元細胞凋亡率升高(P<0.05)；與手術(shù)組比較，TEAS組、西藥組神經(jīng)元細胞凋亡率降低(P<0.05)；TEAS組與西藥組神經(jīng)元細胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3和圖2。

表3 4組大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡率的比較(x±s，%)

圖2 4組海馬組織神經(jīng)元細胞凋亡情況(TUNEL染色，×400)

2.5 各組海馬組織的自噬情況 透射電鏡下可見對照組海馬組織自噬體較少，手術(shù)組自噬體明顯增加，而TEAS組和西藥組自噬體較手術(shù)組減少。見圖3。

2.6 各組自噬相關(guān)蛋白相對表達量的比較 4組海馬組織p-AMPKα、Beclin1、Vps34、蛋白相對表達量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，手術(shù)組、TEAS組、西藥組p-AMPKα、Beclin1、Vps34蛋白相對表達量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均高于對照組(均P<0.05)；與手術(shù)組比較，TEAS組、西藥組以上指標均降低(均P<0.05)，但TEAS組與西藥組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。4組的AMPKα蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4和圖4。

圖3 海馬組織自噬情況(透射電鏡，×10 000)

表4 4組自噬相關(guān)蛋白相對表達量的比較(x±s)

圖4 4組自噬相關(guān)蛋白表達情況

3 討 論

手術(shù)應(yīng)激是導(dǎo)致老年人發(fā)生POCD的主要危險因素之一，加之老年人神經(jīng)細胞數(shù)量減少、腦氧代謝率下降、腦功能減退，常伴隨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，因此易發(fā)生POCD[6]。手術(shù)相關(guān)的機械性損傷、炎癥、心理應(yīng)激等可造成神經(jīng)元變性，甚至引起壞死或凋亡，導(dǎo)致認知功能受損[7]。有動物實驗顯示，老年大鼠行腹部手術(shù)后出現(xiàn)的認知能力下降和行為學(xué)改變與手術(shù)應(yīng)激有關(guān)[8]。本研究的水迷宮實驗和曠場實驗結(jié)果均證實，老年大鼠行腹部手術(shù)后出現(xiàn)認知功能障礙，行為學(xué)發(fā)生異常改變。海馬與學(xué)習(xí)、記憶和情感等高級認知功能密切相關(guān)，術(shù)后應(yīng)激可導(dǎo)致海馬結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起認知功能障礙[9]。本研究中，手術(shù)組海馬組織神經(jīng)元細胞形態(tài)發(fā)生改變，海馬組織神經(jīng)元凋亡明顯。

TEAS以傳統(tǒng)中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論為指導(dǎo)，使用不同頻率電流刺激，通過經(jīng)絡(luò)、腧穴傳導(dǎo)效應(yīng)，改善和消除疾病癥狀。TEAS無痛無創(chuàng)，鎮(zhèn)痛效果良好，臨床廣泛應(yīng)用于慢性疼痛、癌痛鎮(zhèn)痛以及輔助麻醉，療效顯著[10-11]。研究表明，TEAS可明顯改善七氟醚全麻患者術(shù)后出現(xiàn)的嗅覺記憶障礙[12]。此外，穴位刺激可影響腦電變化，激活腦功能區(qū)[13]。動物實驗研究表明，刺激特定穴位，可不同程度地改善腦缺血再灌注引起的海馬神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[14]。頭為諸陽之會，百脈之宗，百會穴位于頭頂正中，為督脈要穴，與腦緊密相連，神庭穴屬督脈經(jīng)穴，足太陽，足陽明之會，刺激百會、神庭可開竅醒腦、安神定志，增強神經(jīng)功能；內(nèi)關(guān)、合谷與三陰交、足三里4穴位陰陽相配，具有健腦醒神、疏經(jīng)活絡(luò)之功。本研究使用TEAS干預(yù)行腹部手術(shù)的老年大鼠的以上穴位，結(jié)果顯示，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和行為學(xué)指標、海馬組織神經(jīng)元細胞形態(tài)均有改善，海馬組織神經(jīng)元凋亡減少，且效果與臨床常用西藥的效果相當，提示TEAS可逆轉(zhuǎn)POCD引起的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)變化，提高學(xué)習(xí)記憶功能，發(fā)揮腦保護作用。

自噬是細胞的一種自我消化過程，在維持神經(jīng)元細胞正常生理功能方面具有重要作用：一方面，自噬可使細胞免于凋亡，維持存活；另一方面，自噬也可促進細胞死亡[15-16]。自噬和細胞凋亡相互作用，共同影響生物體發(fā)育和組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)。本研究透射電鏡觀察顯示，手術(shù)組海馬組織自噬體較對照組明顯增多，經(jīng)TEAS治療后，自噬體明顯減少，這提示POCD過程中自噬激活，而TEAS可抑制自噬，減少神經(jīng)元凋亡，保護神經(jīng)。自噬發(fā)生過程復(fù)雜，受多個信號通路共同調(diào)控，其中AMPK通路是自噬的重要調(diào)控途徑之一[17]。AMPK通路與細胞生存和死亡過程關(guān)系密切，AMPK磷酸化活化后，參與自噬過程[18]。Beclin1蛋白在自噬調(diào)控中發(fā)揮核心作用，參與調(diào)節(jié)自噬起始階段，游離Beclin1可與Vps34結(jié)合，在自噬激活及亞細胞膜定位過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。應(yīng)激情況下，游離Beclin1增加，與Vps34結(jié)合形成Beclin1-Vps34復(fù)合體，激活自噬[20]。LC3蛋白合成后C端被酶切生成LC3-Ⅰ蛋白，自噬發(fā)生后，LC3-Ⅰ蛋白被修飾而形成LC3-Ⅱ蛋白，從而參與自噬形成，是自噬發(fā)生的標志性蛋白[21]。本研究蛋白免疫印跡實驗結(jié)果顯示，手術(shù)組AMPK通路被磷酸化激活，同時Beclin1、Vps34、LC3-Ⅱ表達增加，表明POCD過程伴隨自噬激活。自噬在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用，刺激特定穴位可通過細胞自噬途徑來改善神經(jīng)元損傷[22]。研究顯示，TEAS可有效緩解大鼠超負荷訓(xùn)練引起的心肌細胞凋亡和自噬，減輕心臟重塑[23]。體外實驗研究表明，適當頻率的電刺激可促進巨噬細胞自噬而發(fā)揮抗炎和抗化膿作用[24]。TEAS采用電療結(jié)合穴位經(jīng)絡(luò)，可增強機體防御能力，促進功能恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)TEAS治療后，大鼠海馬組織p-AMPK、Beclin1、Vps34、LC3-Ⅱ蛋白表達明顯減少，提示TEAS可能是通過抑制AMPK信號通路來抑制自噬，減少神經(jīng)元細胞凋亡，保護腦神經(jīng)。

綜上所述，AMPK信號通路活化參與POCD過程中自噬的激活，TEAS治療可改善POCD大鼠認知功能和異常行為，減少神經(jīng)元細胞凋亡，且干預(yù)效果與常用西藥相似，其作用機制可能與抑制AMPK信號通路激活的自噬途徑有關(guān)。