王紅梅 謝 斌 陳寒超 關(guān) 虹 李春蕓

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院1 檢驗科，2 重癥醫(yī)學(xué)科，海南省海口市 570203，電子郵箱：280652847@qq.com)

甲狀腺癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤，其在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈快速增長趨勢[1]。在1974～2013年期間，美國甲狀腺癌發(fā)病率平均每年增加3.6%，病死率每年增加1.1%，已成為美國女性第5大常見癌癥[2-3]。中國東部地區(qū)是甲狀腺癌的高發(fā)地區(qū),并且城市地區(qū)的患病率遠遠高于農(nóng)村地區(qū)[4]。目前，甲狀腺癌的臨床治療以手術(shù)、化療、放療等多模式綜合治療為主，雖然這些治療在一定程度上延長了患者的生存期，但術(shù)后復(fù)發(fā)、耐藥性及放射敏感性嚴重危害患者的身體健康[5]。因此，為改善甲狀腺癌放射治療的效果，有必要進行關(guān)于增強甲狀腺癌細胞放射敏感性方面的研究。微小RNA(microRNA，miRNA)普遍存在于生物體中，是一類長度為18～22 nt的非編碼RNA分子，能夠調(diào)控細胞增殖、分化、遷移、凋亡等多種生物過程[6]。miRNA在人類多種腫瘤組織中表達異常，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，是近年來腫瘤分子研究領(lǐng)域的熱點[7]。已有多項研究表明miRNA-21、miRNA-375等miRNA分子在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[8-9]。而miRNA-181a已被證實在宮頸癌中呈高表達，并且能夠調(diào)節(jié)宮頸癌細胞的放射敏感性[10]。但目前關(guān)于miRNA-181a-3p的研究較少，本文通過檢測體外培養(yǎng)的甲狀腺癌細胞中miRNA-181a-3p的表達水平，以及抑制miRNA-181a-3p聯(lián)合放射照射后細胞的活力及克隆數(shù)，探討miRNA-181a-3p對甲狀腺癌細胞放射敏感性的影響及潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料 甲狀腺癌細胞TPC-1(批號：BNCC337912)、BCPAP(批號：BNCC338685)購自美國菌種保藏中心；正常甲狀腺上皮細胞Nthyori3-1為本實驗室凍存；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(批號：11668027)購自美國Invitrogen公司；TRIzol試劑(批號：15596)、聚偏二氟乙烯膜(批號：BSP0161)、ECL發(fā)光液(批號：PE0030)、RIPA裂解液(批號：R0020)、二甲基亞砜(批號：D8370)、吉姆薩染色液(批號：G1015)購自北京Solarbio公司；胎牛血清(批號：10099-141)、胰蛋白酶(批號：25200056)、RPMI1640培養(yǎng)液(批號：61870044)購自美國Gibco公司；miRNA-181a-3p引物購自TaqMan公司；雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)與熒光素酶報告基因載體(批號：E1910)購自美國Promega公司；inhibitor control(批號：20180205)、miRNA-181a-3p inhibitors(批號：20181002)、空載質(zhì)粒(批號：20180603)、短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)-絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAP3K)質(zhì)粒表達載體(批號：20180105)及其對照質(zhì)粒Vector(批號：20180711)、miRNA-181a-3p mimics(批號：20180402)及其對照mimic control(批號：20180321)均購自廣州瑞銳博生物科技有限公司；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：RR047A)、TaKaRa實時熒光定量試劑盒(批號：RR820A)購自寶生物工程(大連)有限公司；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT；批號：M2129)購自美國Sigma公司；兔抗人MAP3K5多克隆抗體(批號：PAB25031)、兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體(批號：PAB27869)購自上海煊翎生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(批號：ab150077)購自美國Abcam公司。流式細胞儀購自美國BD公司；細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；HBS-1096B型酶標儀購自南京德鐵實驗設(shè)備公司；StepOnePlus實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；萬睿視VAREX直線加速器購自上海艾因蒂克檢測設(shè)備有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 正常甲狀腺上皮細胞Nthyori3-1、甲狀腺癌細胞TPC-1和BCPAP使用含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細胞生長至融合度約80%時進行傳代。收集對數(shù)生長期的TPC-1細胞，胰酶消化后重懸，以5×103個/孔接種至96孔板，細胞融合度為50% 時按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。分別將inhibitor control、miRNA-181a-3p inhibitors、空載質(zhì)粒、shRNA-MAP3K5、shRNA-MAP3K5對照質(zhì)粒Vector和miRNA-181a-3p inhibitors、shRNA-MAP3K5和miRNA-181a-3p inhibitors分別轉(zhuǎn)染至TPC-1細胞，并相應(yīng)標記為anti-miRNA-NC組、anti-miRNA-181a-3p組、Scrambled組、shMAP3K5組、Vector+anti-miRNA-181a-3p組和shMAP3K5+ anti-miRNA-181a-3p組。另設(shè)對照組，即TPC-1細胞中只加入Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，隨后進行放射線照射。

1.3 放射線照射 使用直線加速器行6 MV X射線照射，分別以0、2、4、6、8 Gy照射未經(jīng)轉(zhuǎn)染的對數(shù)生長期TPC-1細胞，以及對照組、anti-miRNA-NC組、anti-miRNA-181a-3p組、Vector+anti-miRNA-181a-3p組、shMAP3K5+ anti-miR-181a-3p組TPC-1細胞，源皮距100 cm照射8 h，于37℃、5%CO2、相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用于定量PCR或MTT實驗。

1.4 定量PCR檢測miRNA-181a-3p表達量 收集未經(jīng)轉(zhuǎn)染和照射的對數(shù)期Nthyori3-1、TPC-1和BCPAP細胞，轉(zhuǎn)染48 h后的對照組、anti-miRNA-NC組、anti-miRNA-181a-3p組TPC-1細胞，以及不同劑量X射線照射的TPC-1細胞，研磨充分后加入TRIzol試劑提取總RNA。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用TaKaRa 熒光定量試劑盒避光配制反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μL/孔，正反向引物0.8 μL/孔，cDNA 1 μL/孔，ddH2O補足體系至20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。以U6為內(nèi)參進行PCR擴增。U6上游引物為5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT -3′，下游引物為5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。每個RNA樣品重復(fù)3次，以2﹣△△Ct法計算各組細胞中miRNA-181a-3p的相對表達量。

1.5 MTT法檢測細胞活力 收集不同劑量X射線照射后的對照組、anti-miRNA-NC組、anti-miRNA-181a-3p組、Vector+anti-miRNA-181a-3p組和shMAP3K5+anti-miRNA-181a-3組TPC-1細胞，加入濃度為5 mg/mL的MTT 20 μL，孵育4 h后吸除培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜振蕩反應(yīng)10 min，酶標儀檢測490 nm處的吸光度(A)值。實驗重復(fù)3次。

1.6 克隆形成實驗 收集經(jīng)4 Gy X射線照射的對照組、anti-miRNA-NC組、anti-miRNA-181a-3p組、Vector+anti-miRNA-181a-3p組和shMAP3K5+anti-miRNA-181a-3p組TPC-1細胞，然后于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d，待細胞集落形成，使用磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次；加入預(yù)冷甲醇固定15 min，吉姆薩液染色30 min，洗去染液，自然晾干后進行克隆計數(shù)。每組6個復(fù)孔，實驗重復(fù)5次。

1.7 蛋白印跡免疫實驗 收集轉(zhuǎn)染48 h后的Scrambled組、shMAP3K5組細胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解，4℃下經(jīng)10 000 r/min離心6 min后取上清。將蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，5% 脫脂奶粉TBST液室溫封閉1 h；分別加入兔抗人MAP3K5多克隆抗體(1 ∶500)和兔抗人GAPDH多克隆抗體(1 ∶250)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次；加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌，ECL發(fā)光顯影，實驗重復(fù)3次。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?采用TargetScan在線工具(http://www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)MAP3K5 3′-UTR上存在miRNA-181a-3p的結(jié)合位點，為驗證MAP3K5是否為miRNA-181a-3p的靶基因，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別將inhibitor control、miRNA-181a-3p inhibitors、mimic control、miRNA-181a-3p mimics與MAP3K5 3′-UTR野生型載體共轉(zhuǎn)染至TPC-1細胞，分別設(shè)為anti-miRNA-NC組、anti-miRNA-181a-3p組、miRNA-NC組、miRNA-181a-3p組。于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，按照雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)說明書，以海腎熒光值為內(nèi)參，應(yīng)用酶標儀檢測螢火蟲與海腎熒光值，以兩者比值作為熒光素酶活性。實驗重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Nthyori3-1、TPC-1和BCPAP細胞中miRNA-181a-3p的表達情況 與Nthyori3-1細胞比較，TPC-1細胞和BCPAP細胞中miRNA-181a-3p的表達均上調(diào)，且TPC-1細胞中miRNA-181a-3p的表達量較BCPAP細胞高(均P<0.05)，故選擇TPC-1細胞進行后續(xù)實驗。見表1。

表1 3種細胞miRNA-181a-3p的相對表達量比較(x±s)

2.2 放射線照射誘導(dǎo)后TPC-1細胞中miRNA-181a-3p的表達情況 與經(jīng)0 Gy照射的TPC-1細胞相比，經(jīng)2、4、6、8 Gy照射的TPC-1細胞中miRNA-181a-3p表達上調(diào)，且表達量呈劑量依賴性(均P<0.05)，見表2。

表2 不同劑量放射線照射后TPC-1細胞中miRNA-181a-3p相對表達量的比較(x±s)

2.3 抑制miRNA-181a-3p表達對TPC-1細胞放射敏感性的影響 轉(zhuǎn)染miRNA-181a-3p inhibitors后，TPC-1細胞中miRNA-181a-3p表達下調(diào)(P<0.05)，見表3。MTT法檢測結(jié)果表明，隨著X射線照射劑量增加，對照組、anti-miRNA-NC組、anti-miRNA-181a-3p組細胞活力逐漸降低(均P<0.05)，且經(jīng)4、6、8 Gy X射線照射的anti-miRNA-181a-3p組細胞活力低于其他兩組(均P<0.05)，而經(jīng)2 Gy X射線照射后3組細胞的活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。經(jīng)4 Gy X射線照射后，anti-miRNA-181a-3p組細胞克隆數(shù)少于對照組和anti-miRNA-NC組(均P<0.05)，見表3。

表3 各組TPC-1細胞轉(zhuǎn)染后miRNA-181a-3p相對表達量和經(jīng)4 Gy X射線照射后克隆數(shù)的比較(x±s)

表4 不同劑量射線照射后各組TPC-1細胞活力的比較(x±s，A值)

2.4 miRNA-181a-3p的靶基因預(yù)測結(jié)果和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果 通過TargetScan在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)，MAP3K5 3′-UTR上存在miRNA-181a-3p的結(jié)合位點(見圖1)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明，與相應(yīng)的對照組比較，miRNA-181a-3p mimics與MAP3K5 3′-UTR野生型載體共轉(zhuǎn)染的細胞中熒光素酶活性降低(P<0.05)，而miRNA-181a-3p inhibitors與MAP3K5 3′-UTR野生型載體共轉(zhuǎn)染的細胞中熒光素酶活性增加(P<0.05)，見表5。

圖1 MAP3K5 3′-UTR與miR-181a-3p的互補序列

表5 各組TPC-1細胞的熒光素酶活性比較(x±s)

2.5 敲減MAP3K5逆轉(zhuǎn)miRNA-181a-3p低表達對TPC-1細胞放射敏感性的增加作用 蛋白免疫印記實驗結(jié)果顯示，shMAP3K5組的MAP3K5蛋白相對表達量為0.269±0.024，低于空載質(zhì)粒組的0.812±0.067 (t=13.215，P<0.001)，見圖2，提示轉(zhuǎn)染shRNA-MAP3K5載體后成功下調(diào)TPC-1細胞的MAP3K5蛋白表達。以不同劑量X射線照射Vector+anti-miRNA-181a-3p組和hsMAP3K5+anti-miRNA-181a-3p組細胞，經(jīng)4、6、8 Gy X射線照射后shMAP3K5+anti-miRNA-181a-3p組細胞活力高于Vector+anti-miRNA-181a-3p組(均P<0.05)；經(jīng)4 Gy照射的shMAP3K5+anti-miRNA-181a-3p組細胞克隆數(shù)多于Vector+anti-miRNA-181a-3p組(P<0.05)。見表6。

圖2 各組細胞中MAP3K5蛋白電泳圖

3 討 論

甲狀腺癌的危險因素較多，包括吸煙、肥胖、輻射、遺傳等，此外，從事放射、醫(yī)療等相關(guān)職業(yè)的工作人員患甲狀腺癌的風(fēng)險也大大增加[11-13]。多數(shù)甲狀腺癌起源于甲狀腺濾泡上皮細胞，包括分化型和未分化型。其中，分化型甲狀腺癌患者經(jīng)手術(shù)治療后存活率較高；但未分化型甲狀腺癌惡性程度高、易轉(zhuǎn)移，不宜采用手術(shù)治療，且對放化療敏感性低，預(yù)后較差[14-15]。近年來，隨著以miRNA為靶點的研究不斷深入，已有研究表明miRNA-106a可調(diào)節(jié)MAPK等信號通路，并可體外抑制甲狀腺癌細胞的凋亡和分化[16]；miRNA-7可通過抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲而在甲狀腺癌中發(fā)揮腫瘤抑制作用[17]。miRNA-181家族包括miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c、miRNA-181d 4個成員，分別定位于3條獨立染色體上，可與多種mRNA互補，參與各種生理、病理過程[18]。miRNA-181a在多種腫瘤組織中異常表達，已有相關(guān)文獻報告，miRNA-181a在非小細胞肺癌和口腔鱗狀細胞癌等腫瘤組織中呈低表達，能夠通過調(diào)節(jié)細胞周期來抑制細胞增殖，并且與病情分級顯著相關(guān)[19-20]。此外，Ke 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-181a在對放射敏感的宮頸癌組織中表達上調(diào)，可抑制輻射誘導(dǎo)的細胞凋亡，其表達水平可作為對放射治療敏感的標志物。在甲狀腺癌的相關(guān)研究中，miRNA-181a已被證實在甲狀腺癌組織中呈高表達[21]；miRNA-181a-3p從miRNA-181a前體的3′端臂加工而來，miRNA-181a-5p從miRNA-181a前體的5′端臂加工而來，具有抑制癌細胞增殖和侵襲的作用[22]。本研究定量PCR檢測結(jié)果提示，miRNA-181a-3p在甲狀腺癌細胞TPC-1和BCPAP中表達上調(diào)，與上述結(jié)果一致。此外，經(jīng)X射線照射后TPC-1細胞中的miRNA-181a-3p表達上調(diào)，且表達水平與照射劑量呈劑量依賴性(P<0.05)；但抑制miRNA-181a-3p表達后，隨著X射線照射劑量的增加TPC-1細胞的活力逐漸降低，經(jīng)4 Gy X射線照射后細胞克隆形成數(shù)減少(P<0.05)。這表明抑制miRNA-181a-3p表達可增強TPC-1甲狀腺癌細胞的放射敏感性。

通過TargetScan在線預(yù)測并進行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C，發(fā)現(xiàn)MAP3K5是miRNA-181a-3p的靶基因。MAP3K5是MAP3K家族成員之一，又名細胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1，可被多種促炎因子和應(yīng)激損傷激活，從而激活c-Jun氨基末端激酶和p38蛋白，誘導(dǎo)細胞凋亡[23]。同為MAP3K家族成員的MAP3K1已被證實與乳腺癌的發(fā)病有關(guān)[24]；MAP3K10可調(diào)節(jié)癌細胞增殖和化學(xué)敏感性[25]。Pressinotti等[26]的研究表明，MAP3K5與前列腺癌的惡性程度相關(guān)。但目前尚未見針對MAP3K5與甲狀腺癌之間關(guān)系的研究。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)4、6、8 Gy X射線照射后shMAP3K5+anti-miRNA-181a-3p組細胞活力高于Vector+anti-miRNA-181a-3p組(均P<0.05)；經(jīng)4 Gy X射線照射的shMAP3K5+anti-miRNA-181a-3p組細胞克隆數(shù)多于Vector+anti-miRNA-181a-3p組(P<0.05)。這表明，敲減MAP3K5可逆轉(zhuǎn)miRNA-181a-3p表達下調(diào)對TPC-1細胞放射敏感性的增加作用。

綜上所述，miRNA-181a-3p在甲狀腺癌細胞中表達上調(diào)，抑制miRNA-181a-3p表達可增強甲狀腺癌TPC-1細胞的放射敏感性，其機制可能與MAP3K5有關(guān)。這一研究結(jié)果或可為甲狀腺癌的放射治療提供新靶點。