黃進(jìn)英

【摘要】文章主要是分析了血液制品染菌的危害，在此基礎(chǔ)上講解了細(xì)菌污染途徑及控制措施，最后探討了幾種有效能夠滅活病毒的方法，望可以為有關(guān)人員提供到一定的參考和幫助。

【關(guān)鍵詞】血液制品;病毒滅活;原理;安全性

【中圖分類號(hào)】R392-33 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2021.12.210

前言

血液制品主要是從一些健康的血液中通過(guò)分離、純化或由DNA重組技術(shù)所創(chuàng)新制備出來(lái)的白蛋白類、球蛋白類以及凝血因子類等，這些血液制品可以有效的在急救、疾病預(yù)防所需要用到的藥物上，血液制品的安全是人們共同關(guān)注的重要問(wèn)題，為此如何有效的去除其中的病毒是科學(xué)人員應(yīng)當(dāng)不斷進(jìn)行探索和解決的難點(diǎn)。

1 ?血液制品染菌的危害

血液制品污染引起的菌血癥最初是通過(guò)輸血并發(fā)癥來(lái)的。雖然菌血癥的發(fā)病率不高，但會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。據(jù)報(bào)道，1986年至1989年，美國(guó)共有7例患者因輸注細(xì)菌污染的血小板而死亡，盡管大多數(shù)液體血液制品在污染后可能出現(xiàn)明顯的生物膜、霉菌團(tuán)和絲狀物，或液體渾濁、產(chǎn)生顆粒和氣體，這些都可以通過(guò)清晰度檢測(cè)出來(lái)，但對(duì)于那些單瓶?jī)龈裳褐破吩诜盅b或凍干過(guò)程中，細(xì)菌感染后不易被檢出，對(duì)患者造成了一定的威脅。

2 ?細(xì)菌污染途徑及控制措施

細(xì)菌污染可能發(fā)生在整個(gè)血液制品的生產(chǎn)過(guò)程中。潛在的有害細(xì)菌通常來(lái)自原料或個(gè)人接觸受污染的產(chǎn)品。由于細(xì)菌污染途徑的多樣性，通常很難控制被污染的細(xì)菌。因此，為可以制備安全可靠的血液制品，至少應(yīng)從原血漿、原材料和包裝過(guò)程的質(zhì)量控制方面采取到了有效的控制措施。

2.1原料血漿污染

在血液收集和血漿分離過(guò)程中消毒效果不佳，血液收集前的消毒效果不佳，血液收集器和血漿容器的不完全消毒將直接影響原始血漿的質(zhì)量。結(jié)果表明，主要污染細(xì)菌是G B細(xì)菌。在血液收集和血液捐贈(zèng)的消毒作用和血漿中的污染細(xì)菌中檢測(cè)到細(xì)菌之間存在一定的關(guān)系。孤立的細(xì)菌主要是G B細(xì)菌。因此，在血液收集前嚴(yán)格的消毒和無(wú)菌操作是確保血漿無(wú)菌性的重要前提。按照世界衛(wèi)生組織（1995年版）的規(guī)定，應(yīng)以一種方式對(duì)血液供血的靜脈刺穿部位的皮膚，以確保血液收集是沒(méi)有細(xì)菌的。當(dāng)血液按照無(wú)菌程序收集到容器中時(shí)，原料血漿的最大細(xì)菌計(jì)數(shù)應(yīng)在投料前控制50cfu/ml。涂層分離應(yīng)在無(wú)菌封閉的塑料袋系統(tǒng)中進(jìn)行。防止分離血漿再次被細(xì)菌污染，應(yīng)該在6小時(shí)內(nèi)冷凍并儲(chǔ)存-25℃。

2.2原輔料的污染

因?yàn)槎喾N原料和輔助材料如糖，酒精或一些化學(xué)試劑，輔料、包括生產(chǎn)水、可能導(dǎo)致由于微生物污染，原料和輔助材料如氨基酸和使用的含有副產(chǎn)品的細(xì)菌污染在靜脈內(nèi)免疫球蛋白的制備中應(yīng)計(jì)數(shù)細(xì)菌，并且在使用前應(yīng)該消毒并過(guò)濾滅菌原料和過(guò)濾，并且應(yīng)該進(jìn)行消毒和過(guò)濾，每次進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌計(jì)數(shù)制定了原料和輔助材料，以及相應(yīng)的許可和排斥限制標(biāo)準(zhǔn)。

2.3分裝過(guò)程的污染

為可以保證滅菌系統(tǒng)的安全性和無(wú)菌包裝質(zhì)量的可靠性，在滅菌和過(guò)濾前應(yīng)對(duì)濾膜的泡點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。無(wú)菌室的清潔是保證產(chǎn)品無(wú)菌質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。FDA指出，保證產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵是在極高的環(huán)境質(zhì)量條件下對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行包裝和密封。無(wú)菌室中的微生物含量不應(yīng)超過(guò)25 CFU/10立方英尺是可以接受的。我國(guó)藥品生產(chǎn)管理標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)菌室的無(wú)菌等級(jí)是萬(wàn)級(jí)≤1cfu/平均。工人的頻繁活動(dòng)導(dǎo)致灰塵附著的細(xì)菌污染產(chǎn)品。按照人們?cè)跓o(wú)菌室中的人們的活動(dòng)的粒子狀態(tài)，從靜態(tài)狀態(tài)產(chǎn)生到快速移動(dòng)狀態(tài)的顆?？梢援a(chǎn)生100000/min-3千萬(wàn)/min。因此，分配人員應(yīng)加強(qiáng)無(wú)菌概念和無(wú)菌手術(shù)技術(shù)，定期在分配人員手指上進(jìn)行細(xì)菌文化，并為分配人員和血液產(chǎn)品建立一個(gè)系統(tǒng)。在儲(chǔ)存或運(yùn)輸過(guò)程中，由于擠壓，容器損壞，因此，選擇高質(zhì)量的儲(chǔ)存容器非常重要。

3 ?經(jīng)血傳播的病原體

理論上，如果病毒感染時(shí)出現(xiàn)病毒血癥，則可能通過(guò)輸血和血液制品傳播。經(jīng)確認(rèn)的血源病毒包括HIV、甲型肝炎病毒、乙肝病毒、丙型肝炎病毒、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒和G型肝炎病毒、輸血傳播病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、人T淋巴細(xì)胞白血病病毒、EB病毒、人類皰疹病毒-8、人細(xì)小病毒B19、西尼羅河病毒等。在采取有效的原始血漿篩查和病毒滅活/清除措施前，報(bào)告了HIV、HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、HGV、TTV、B19等血液制品。突變病原體是一種只含一種蛋白質(zhì)而不含核酸的病原體，目前還沒(méi)有證據(jù)表明它可以通過(guò)血液制品傳播，但近年來(lái)，又有一起疑似輸血感染凝血因子Ⅷ的病例報(bào)道。世界各國(guó)已經(jīng)進(jìn)行了更為準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，尚不能排除這些風(fēng)險(xiǎn)。在生產(chǎn)血液產(chǎn)品的過(guò)程中，可以通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾除去細(xì)菌，寄生蟲和其他病原體，這不會(huì)對(duì)血液產(chǎn)品的安全構(gòu)成威脅。

4 ?獻(xiàn)漿員的遴選與病原體檢測(cè)

原料血漿的質(zhì)量是保證血液制品安全的首要條件。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，世界各國(guó)已經(jīng)形成了一套嚴(yán)格的血漿采集和供應(yīng)體系。以美國(guó)為例，F(xiàn)DA從1973年開(kāi)始對(duì)血漿采集和供應(yīng)機(jī)構(gòu)進(jìn)行監(jiān)督管理，通過(guò)質(zhì)量保證、血漿捐獻(xiàn)者資格認(rèn)證、臨床試驗(yàn)認(rèn)證、實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證、藥物警戒等五大質(zhì)量體系，建立了一套完整的管理體系和監(jiān)測(cè)體系，血漿采集/處理、檢疫/儲(chǔ)存/處置系統(tǒng)包括血漿供體篩查、檢疫隔離、血漿檢測(cè)等五個(gè)安全環(huán)節(jié)，事故監(jiān)測(cè)和調(diào)查有效保障了血漿采集的安全和原料血漿的質(zhì)量。目前，血液產(chǎn)品僅由中國(guó)等離子交換收集的固定健康人血漿產(chǎn)生。從理論上講，風(fēng)險(xiǎn)很小。中國(guó)有超過(guò)100個(gè)血漿分離站，由各種血液制品企業(yè)進(jìn)行操作和管理，并嚴(yán)格受到國(guó)家的監(jiān)督。其管理系統(tǒng)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基本達(dá)到了歐洲和美國(guó)發(fā)達(dá)國(guó)家的水平。首先，有必要嚴(yán)格選擇血漿捐贈(zèng)者，包括健康狀況，體檢和驗(yàn)血。只有令人滿意的結(jié)果只能提供血漿。在血漿收集后，一系列病毒試驗(yàn)應(yīng)在單血漿上進(jìn)行，并預(yù)先生產(chǎn)的混合血漿，以確保沒(méi)有病毒污染。各國(guó)都出臺(tái)了相關(guān)規(guī)定或指導(dǎo)方針，并嚴(yán)格對(duì)原漿病毒檢測(cè)、血漿篩查方法、僅進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，由于檢測(cè)靈敏度等局限性，病毒抗體在陽(yáng)轉(zhuǎn)血漿樣本內(nèi)潛伏期（窗口期）會(huì)產(chǎn)生不可避免的誤解，導(dǎo)致部分血液制品（如脆性凝血因子VIII）傳播血源病毒，因此自上世紀(jì)90年代以來(lái)，發(fā)達(dá)國(guó)家在加強(qiáng)病毒滅活/去除過(guò)程的同時(shí)，提高了核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，提高了血液制品的檢測(cè)水平。在我國(guó)的藥典中，血液產(chǎn)品的血漿血漿應(yīng)通過(guò)氨胺轉(zhuǎn)移酶，乙型肝炎表面抗原，HIV1/2抗體，HCV抗體檢測(cè)，NAT測(cè)試，歐洲藥物管理，單次失敗需要HBsAg，HIV1/2ARIBODIES，HCV抗體，HCSAG，HIV1/2抗體，HCVRNA，此外，病毒滅活的混合血漿增加了B19DNA和HAVRNA兩種測(cè)試項(xiàng)目，用于產(chǎn)生抗D免疫球蛋白混合血漿增加檢測(cè)B19DNA。按照美國(guó)藥品和食品管理局發(fā)布的指南，原料血漿應(yīng)進(jìn)行HBSAG、HiVRNA、HCV抗體和HCV RNA檢測(cè)，此外，F(xiàn)DA還建議生產(chǎn)商進(jìn)行B19 DNA檢測(cè)，以確保血液制品的安全性，同時(shí)遵守相關(guān)法律法規(guī)，許多血液制品制造商都加入了國(guó)際血漿蛋白治療配方，并自愿對(duì)少量混合血漿進(jìn)行檢測(cè)，如CSLBehring、Octopharma等公司自愿對(duì)少量混合血漿進(jìn)行HiVRNA、HAVRNA、B19DNA檢測(cè)。

5 ?檢疫期管理

原料檢疫期的管理是指按照試驗(yàn)結(jié)果提供的原料血漿生產(chǎn)的技術(shù)措施，并在單位血漿站提供的固結(jié)原料血漿的一段時(shí)間之后，以及再血漿的血漿樣品按照測(cè)試結(jié)果進(jìn)行測(cè)試。國(guó)家食品和藥物管理局于2007年發(fā)布相關(guān)規(guī)定，規(guī)定原料血漿的檢疫期不低于90天，即收集和測(cè)試原料血漿體90天，合格的原料血漿只能在樣品的質(zhì)粒血漿中進(jìn)行測(cè)試和合格。2008年，進(jìn)一步規(guī)定，如果血液制造商增加病毒核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑以在酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的基礎(chǔ)上檢測(cè)血漿樣品，則每日起始時(shí)間限制不小于60天。歐洲和歐洲等發(fā)展國(guó)家美國(guó)使用NAT篩查病毒篩查原料血漿，從而縮短窗口，因此，制造商本身通常使用或確定60天結(jié)賬期。檢疫時(shí)間管理的管理原料血漿可以有效降低缺乏的風(fēng)險(xiǎn)在窗口期間檢查，這是能夠有效控制到了原料血漿的有效措施之一。

6 ?光化學(xué)病毒滅活方法

補(bǔ)骨脂素光化學(xué)法是使用其化學(xué)光敏性與致病微生物的核酸或蛋白質(zhì)結(jié)合，并且在光的條件下發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，使病原體滅活并且病毒不能復(fù)制，從而有效地滅活病毒在血漿中。病毒滅活方法可以有效地滅活大多數(shù)DNA病毒，RNA病毒，脂質(zhì)涂覆的病毒和非脂質(zhì)涂覆的病毒在血漿中，但對(duì)于光化學(xué)的抗性細(xì)小病毒而言是無(wú)效的。因?yàn)榕Ｄ倘┕饣瘜W(xué)方法對(duì)病毒核酸直接影響，但對(duì)血漿中的其他蛋白質(zhì)成分幾乎沒(méi)有影響，它通常用于滅活血小板和凝血因子。亞甲藍(lán)是一種含正電荷的吩噻嗪衍生物，由Heinrich Caro于1876年首次合成。亞甲藍(lán)化學(xué)方法是利用theraflex亞甲藍(lán)血漿系統(tǒng)在輕量條件下形成單線氧或自由基，破壞原結(jié)構(gòu)核酸對(duì)病原體進(jìn)行殺菌，是我國(guó)唯一批準(zhǔn)臨床應(yīng)用的技術(shù)，而核化學(xué)病毒的核化學(xué)方法是近年來(lái)光volumy研究的熱點(diǎn)之一，它利用紫外光或可見(jiàn)光照射和氧化傳遞電子，仍在破壞核酸骨架以使病毒失活。該方法可以有效地滅活產(chǎn)物中的病原細(xì)菌，對(duì)蛋白質(zhì)含量沒(méi)有明顯影響。核魚素是人體的必需維生素，照明后的代謝物與人體相同。因此，通過(guò)該方法制備的血液產(chǎn)品對(duì)人體造成較小。一方面，它會(huì)導(dǎo)致核酸的突變，阻礙核酸的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的失敗;另一方面，自由基的生產(chǎn)引起光相化，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和病毒失活。這種方法可以用于病毒在血小板中的滅活，但它們的失活時(shí)間影響血小板的質(zhì)量，非活性時(shí)間越長(zhǎng)，血小板損傷的變化越大，蛋白質(zhì)濃度會(huì)影響滅活效果，蛋白質(zhì)濃度越高的情況下會(huì)使得紫外線穿透力越弱，滅活效果越差。

7 ?病毒滅活/去除工藝

血液制品的病毒失活/去除過(guò)程是能夠有效的防止到了血液產(chǎn)品中血型病毒傳播的關(guān)鍵措施。各國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)發(fā)布的相關(guān)法規(guī)/指南是強(qiáng)制性文件，也是制造商關(guān)注的關(guān)鍵過(guò)程鏈接之一。2002年，國(guó)家食品和藥物管理局發(fā)布了血液制品排毒/失活的技術(shù)方法和驗(yàn)證指南。顯然需要在生產(chǎn)過(guò)程中存在某種病毒去除/滅活能力，并且在生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)該有特異性病毒去除/滅活方法。一種有效可靠的病毒滅活/去除方法通常要求病毒滴度≥4病毒滅活/去除后的日志，易于模擬和確認(rèn)。對(duì)于工藝條件的變化，為可以最大限度地激活或去除原血漿中可能被污染的病毒，世衛(wèi)組織要求在每種產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程中采用兩種或兩種以上的方法對(duì)病毒進(jìn)行滅活或去除，才可以有效的確保到了產(chǎn)品的病毒安全。目前的失活技術(shù)包括熱處理（包括巴氏殺菌，干熱，蒸汽加熱），有機(jī)溶劑/表面活性劑（S/D）和低pH培養(yǎng)物。在1948年以來(lái)，巴氏殺菌已用于人血清白蛋白產(chǎn)品。到目前為止，已經(jīng)證實(shí)了加工的人血清白蛋白作為無(wú)病毒產(chǎn)品，并已寫入世衛(wèi)組織生物制品規(guī)定，但這種方法不適用于凝血因子產(chǎn)品的失活，低pH孵育方法僅適用于免疫球蛋白產(chǎn)品的滅活當(dāng)中。解毒技術(shù)包括沉淀（低溫乙醇），色譜和納米過(guò)濾。低溫乙醇方法和色譜法都具有一定的解毒能力。單一應(yīng)用不能完全保證病毒去除，并且需要添加其他特定病毒失活/去除方法。S/D方法首先報(bào)道于1985年，是病毒失活/去除方法的第一個(gè)飛躍，其被認(rèn)為是消除包膜病毒的絕對(duì)有效的方法。1994年報(bào)道的納濾方法是病毒失活/去除方法的第二次飛躍。該方法解決了去除甲型肝炎，B19和其他小病毒的問(wèn)題，但它不適合所有血液制品，并且使用成本相對(duì)較高，這限制了該方法的應(yīng)用，并確保了血液產(chǎn)品的病毒安全性。

8 ?結(jié)束語(yǔ)

由上可知，血液制品滅活的方法、原理以及機(jī)制等都存在了一些不同，選擇科學(xué)合理的病毒滅活方法有著十分重要的意義。滅活病毒是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，為能夠有效確保到血液制品的安全性，科學(xué)人員應(yīng)當(dāng)在滅活病毒等方面繼續(xù)的努力前進(jìn)。

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