何玉清， 亢澤峰， 李 凌， 關(guān)瑞娟

(1.青海省人民醫(yī)院眼科，青海 西寧 810007；2.中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院眼科，北京 100040)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病的一種微血管并發(fā)癥，更是導(dǎo)致視力下降的主要原因[1]。視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRCEC)是血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的重要組分，高糖刺激可促進(jìn)HRCEC增殖和遷移，進(jìn)而促進(jìn)新血管形成，導(dǎo)致出血、牽拉性視網(wǎng)膜脫離，最終造成視力喪失[2-3]。因此，降低高糖刺激下HRCEC的增殖和遷移能力有望成為DR治療的新方向。山楂葉總黃酮是從山楂樹葉子中提取的黃酮類化合物的總稱，能有效降低2型糖尿病大鼠血糖，提高機(jī)體抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激損傷[4]，它通過抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞muller激活，提高谷氨酰胺合成酶活性，對(duì)糖尿病眼病防治意義重大[5]。基于上述研究，本研究旨在探討山楂葉總黃酮對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCEC增殖和遷移的影響及其潛在機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞 視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRCEC)，購于美國模式培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 試劑與藥物 DMEM培養(yǎng)液(批號(hào)907039)、胎牛血清(批號(hào)10270-106)購自美國Gibco公司；青鏈霉素雙抗溶液(批號(hào)P1400)購自北京索萊寶生物科技有限公司。山楂葉總黃酮(含量≥95%，批號(hào)20140213)購于晉城中晉藥業(yè)有限公司。VEGF小干擾RNA(si-VEGF)及其陰性對(duì)照(si-NC)、PCR引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)RR047A)、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(批號(hào)RR820A)購自寶生物工程(大連)有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)(批號(hào)C0009)、兔源Ki67抗體(AF1738)、兔源上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體(AF6759)、兔源神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)抗體(AF0243)、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體(AF1186)、山羊抗兔IgG(A0208)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 MK3型酶標(biāo)儀，購自美國Thermo公司；iQ5型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，購自美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HRCEC采用含10%胎牛血清、5%青鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液于37 ℃、含5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照1∶2比例傳代，每隔2 d換液1次，取對(duì)數(shù)期HRCEC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞分組和處理 細(xì)胞分為對(duì)照組，模型組，山楂葉總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組，其中對(duì)照組、模型組分別用含25、90 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液處理細(xì)胞5 d；山楂葉總黃酮低劑量、中劑量、高劑量組用含90 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液處理細(xì)胞4 d后，分別加入125、250、500 ng/mL山楂葉總黃酮培養(yǎng)液處理24 h。

本實(shí)驗(yàn)將山楂葉總黃酮高劑量+si-NC組為轉(zhuǎn)染si-NC后，用含90 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液處理細(xì)胞4 d，加入500 ng/mL的山楂葉總黃酮的培養(yǎng)液處理24 h；山楂葉總黃酮高劑量+si-VEGF組為轉(zhuǎn)染si-VEGF后，用含90 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液處理細(xì)胞4 d，加入500 ng/mL山楂葉總黃酮的培養(yǎng)液處理24 h。

2.3 MTT法檢測細(xì)胞活力 細(xì)胞按“2.2”項(xiàng)下方法分組和處理后，取3×103個(gè)接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后每孔添加20 μL MTT試劑，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，每孔加入150 μL二甲基亞砜，低速搖床振蕩10 min至結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀檢測490 nm處各孔光密度(OD)值。

2.4 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測克隆形成能力 細(xì)胞按“2.2”項(xiàng)下方法分組和處理后，制備單細(xì)胞懸液，取200個(gè)(5 mL)接種到直徑為60 mm的培養(yǎng)皿中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿式細(xì)胞分散均勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，甲醇固定15 min，吉姆薩染色10 min，顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

2.5 Transwell法檢測細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞按“2.2”項(xiàng)下方法分組和處理后，用無血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，取2 000個(gè)(200 μL)接種到Transwell上室，取500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基加到24孔板下室，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棉拭子擦去未穿膜細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以平均值表示遷移細(xì)胞數(shù)量。

2.6 蛋白質(zhì)印記檢測Ki67、E-cadherin、N-cadherin表達(dá) 細(xì)胞按“2.2”項(xiàng)下方法分組和處理后，RIPA裂解提取總蛋白，測定濃度，取30 μg作聚丙烯酰胺凝膠電泳，按照濕法轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、避光顯影、灰度分析步驟進(jìn)行操作，以目的蛋白和GAPDH灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)。

2.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA表達(dá) 細(xì)胞按“2.2”項(xiàng)下方法分組和處理后，Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，利用SYBR Green master mix進(jìn)行qPCR，以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCT法檢測VEGFmRNA表達(dá)。VEGF正向引物5′-AGACCCTCTCCACCAACCAGT-3′，VEGF反向引物5′-TACGACTCGCGTCAACCG-3′；GAPDH正向引物5′-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3′，GAPDH反向引物5′-GAACGGGAAGCTCACTGG-3′。

3 結(jié)果

3.1 山楂葉總黃酮對(duì)高糖處理的HRCEC增殖的影響 與對(duì)照組比較，模型組HRCEC細(xì)胞活力、克隆數(shù)、Ki67蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，山楂葉總黃酮低、中、高劑量組HRCEC細(xì)胞活力、克隆數(shù)、Ki67蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與山楂葉總黃酮低劑量組比較，山楂葉總黃酮中劑量組HRCEC細(xì)胞活力、克隆數(shù)、Ki67蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與山楂葉總黃酮中劑量組比較，山楂葉總黃酮高劑量組HRCEC細(xì)胞活力、克隆數(shù)、Ki67蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖1～2、表1。

圖1 各組HRCEC克隆形成數(shù)

圖2 各組Ki67蛋白表達(dá)

表1 山楂葉總黃酮對(duì)高糖處理的HRCEC增殖的影響

3.2 山楂葉總黃酮對(duì)高糖處理的HRCEC遷移的影響 與對(duì)照組比較，模型組HRCEC遷移數(shù)、N-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，山楂葉總黃酮低、中、高劑量組HRCEC遷移數(shù)、N-cadherin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與山楂葉總黃酮低劑量組比較，山楂葉總黃酮中劑量組HRCEC遷移數(shù)、N-cadherin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與山楂葉總黃酮中劑量組比較，山楂葉總黃酮高劑量組HRCEC遷移數(shù)、N-cadherin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖3～4、表2。

圖3 各組HRCEC遷移細(xì)胞數(shù)

圖4 各組E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)

表2 山楂葉總黃酮對(duì)高糖處理的HRCEC遷移的影響

3.3 山楂葉總黃酮對(duì)高糖處理的HRCEC中VEGF表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組HRCEC中VEGFmRNA表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，山楂葉總黃酮低、中、高劑量組HRCEC中VEGFmRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與山楂葉總黃酮低劑量組比較，山楂葉總黃酮中劑量組HRCEC中VEGFmRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與山楂葉總黃酮中劑量組比較，山楂葉總黃酮高劑量組HRCEC中VEGFmRNA表達(dá)降低(P<0.05)。見表3。

表3 山楂葉總黃酮對(duì)高糖處理的HRCEC中VEGF表達(dá)的影響

3.4 干擾VEGF增強(qiáng)山楂葉總黃酮對(duì)高糖處理的HRCEC增殖的影響 與山楂葉總黃酮高劑量+si-NC組比較，山楂葉總黃酮高劑量+si-VEGF組HRCEC中VEGFmRNA表達(dá)、細(xì)胞活力、克隆數(shù)、Ki67蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖5～6、表4。

圖5 加入干擾VEGF后各組HRCEC克隆數(shù)

圖6 加入干擾VEGF后各組Ki67蛋白表達(dá)

表4 干擾VEGF增強(qiáng)山楂葉總黃酮對(duì)高糖處理的HRCEC增殖的影響

3.5 干擾VEGF增強(qiáng)山楂葉總黃酮對(duì)高糖處理的HRCEC遷移的影響 與山楂葉總黃酮高劑量+si-NC組比較，山楂葉總黃酮高劑量+si-VEGF組HRCEC遷移細(xì)胞數(shù)、N-cadherin蛋白表達(dá)降低，E-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見圖7～8、表5。

表5 干擾VEGF增強(qiáng)山楂葉總黃酮對(duì)高糖處理的HRCEC遷移的影響

圖7 加入干擾VEGF后各組HRCEC遷移細(xì)胞數(shù)

4 討論

圖8 加入干擾VEGF后各組E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)

研究顯示，山楂葉總黃酮通過改善抗氧化酶活性，提高機(jī)體清除自由基能力，降低氧化應(yīng)激損傷，對(duì)糖尿病大鼠腦損傷、肝損傷、胰腺組織損傷具有保護(hù)作用[6-8]，還可降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及黏附能力[9]。Ki67是一種細(xì)胞增殖相關(guān)核抗原，與細(xì)胞的有絲分裂密切相關(guān)，其表達(dá)是反應(yīng)細(xì)胞增殖能力和活躍程度的重要指標(biāo)[10]。E-cadherin和N-cadherin是鈣離子依賴的細(xì)胞粘附素家族成員，對(duì)維持細(xì)胞極性和完整性具有重要作用，E-cadherin表達(dá)缺失、N-cadherin表達(dá)增加可促進(jìn)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[11]。本研究顯示，高糖刺激后HRCEC中Ki67和E-cadherin蛋白表達(dá)、細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)明顯升高，N-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，而山楂葉總黃酮呈劑量依賴性地降低HRCEC活力、克隆形成和遷移能力，促進(jìn)Ki67和E-cadherin蛋白表達(dá)，提示山楂葉總黃酮可抑制高糖誘導(dǎo)的HRCEC的增殖、遷移和侵襲。

VEGF一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，其通過與內(nèi)皮細(xì)胞膜上VEGF受體結(jié)合，激活下游絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信號(hào)通路，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞生長和血管增生[12]。研究顯示，DR患者視網(wǎng)膜組織中VEGF高表達(dá)與視網(wǎng)膜新生血管形成密切相關(guān)，抑制VEGF表達(dá)可誘導(dǎo)HRCEC細(xì)胞周期阻滯，發(fā)揮抗增殖作用[13-14]。此外，抑制瞬時(shí)受體電位陽離子通道(TRPC)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRCEC增殖、遷移和管腔形成的阻礙作用可能與抑制VEGF表達(dá)有關(guān)[3]。本研究顯示，高糖刺激后HRCEC中VEGFmRNA表達(dá)明顯升高，而山楂葉總黃酮呈劑量依賴性地抑制高糖誘導(dǎo)的VEGFmRNA表達(dá)，干擾VEGF表達(dá)可增強(qiáng)山楂葉總黃酮對(duì)高糖處理的HRCEC增殖、遷移的抑制作用。

綜上所述，山楂葉總黃酮可通過下調(diào)VEGF表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的HRCEC增殖和遷移，能為關(guān)于該成分防治DR的研究奠定理論基礎(chǔ)。