彭 瀟， 雷 艷， 陳思穎， 聶開品， 楊 純， 王愛民， 李勇軍*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心/省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004；4.貴州大隆藥業(yè)有限責(zé)任公司，貴州 貴陽(yáng) 550004；5.畢節(jié)市第一人民醫(yī)院，貴州 畢節(jié) 551700)

舒眠膠囊為國(guó)家基本藥物目錄所收載的中藥復(fù)方制劑[1]，由酸棗仁(炒)、柴胡(酒炒)、白芍(炒)、合歡花等8味藥材組成，具有疏肝解郁、寧心安神的療效[2]，主要用于肝郁傷神所致的失眠癥，安全性和臨床療效較好，且應(yīng)用廣泛[3-5]。方中酸棗仁含有的斯皮諾素等黃酮類物質(zhì)具有鎮(zhèn)靜催眠及抗抑郁藥理作用[6]，白芍中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等主要成分有抗驚厥等生物學(xué)效應(yīng)，具有明顯的鎮(zhèn)靜、抗抑郁活性[7]，合歡花總黃酮有抗抑郁作用，其中槲皮苷為鎮(zhèn)靜催眠的有效成分[8-9]。舒眠膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第33冊(cè)》，僅對(duì)制劑中芍藥苷進(jìn)行了定量檢測(cè)[10]，而含多種有效活性成分的中藥復(fù)方制劑是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)聯(lián)合作用起療效，對(duì)其中某單一成分的定量檢測(cè)并不足以全面評(píng)估制劑的質(zhì)量的優(yōu)劣及安全性、有效性與穩(wěn)定性，多組分評(píng)價(jià)模式已成為發(fā)展趨勢(shì)[11]。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定舒眠膠囊中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷的含量，以期為該制劑的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)奠定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；AE-240型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；超純水機(jī)(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試藥 15批舒眠膠囊(每粒裝0.4 g，批號(hào)20160721、20160722、20160801、20171201、20171006、20171108、20171002、20170504、20170601、20170910、20170702、20170305、20170404、20170205、20170103)編號(hào)S1～S15，均由貴州大隆藥業(yè)有限責(zé)任公司提供。酸棗仁、柴胡、白芍、合歡花、合歡皮、蟬蛻、僵蠶、燈心草均由貴州大隆藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)劉春花副教授鑒定為正品。芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、槲皮苷、斯皮諾素對(duì)照品均購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司，純度均≥98%，批號(hào)分別為wkq18050205、wkq18032104、wkq18041101、wkq18060104。乙腈為色譜純；甲醇、乙醇等試劑均為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters CORTECS C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-水(含0.1%磷酸)(B)，梯度洗脫(0～20 min，10%～15%A；20～30 min，15%～16%A；30～40 min，16%～18%A；40～42 min，18%～95%A)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)242 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取上述4種對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含芍藥內(nèi)酯苷2.362 mg、芍藥苷2.560 mg、斯皮諾素0.945 mg、槲皮苷2.040 mg的貯備液，精密量取適量，置于5 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL分別含四者0.755 8、0.819 2、0.075 6、0.204 0 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取膠囊內(nèi)容物1 g，置于磨口具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲(200 W、40 kHz)處理30 min，取出，放冷，50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取上清液，0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方比例及制劑工藝，分別制成缺酸棗仁(炒)、缺白芍(炒)、缺合歡花的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 取“2.2”項(xiàng)下各溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，發(fā)現(xiàn)陰性無(wú)干擾，各成分分離度良好(R>1.5)，表明該方法專屬性良好，見圖1。

1.芍藥內(nèi)酯苷 2.芍藥苷 3.斯皮諾素 4.槲皮苷

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，甲醇制成不同質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密稱取膠囊(S3)內(nèi)容物1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷峰面積RSD分別為2.0%、1.0%、0.62%、0.68%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取膠囊(S3)內(nèi)容物1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷含量RSD分別為1.8%、1.6%、1.4%、1.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取膠囊(S3)內(nèi)容物1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷峰面積RSD分別為0.39%、0.49%、1.5%、0.85%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取4種成分含量已知的膠囊(S3)內(nèi)容物6份，每份0.5 g，精密加入各對(duì)照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3.7 樣品含量測(cè)定 取15批膠囊，每批2份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法篩選 本實(shí)驗(yàn)首先考察了回流、超聲提取，再考察了提取溶劑甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇、25%乙醇、水，最后考察了提取時(shí)間30、60、90、120 min，最終確定采用50%甲醇超聲提取30 min作為供試品溶液制備方法，此時(shí)指標(biāo)成分提取率較高，峰形對(duì)稱性較好。

3.2 色譜條件篩選 本實(shí)驗(yàn)首先考察了艾杰爾Venusil XBP(L) C18、沃特世 Waters CORTECS C18色譜柱，然后考察了流動(dòng)相甲醇-水、甲醇-水(含0.1%磷酸)、乙腈-水(含0.1%磷酸)、乙腈-水(含0.1%甲酸)對(duì)色譜峰的影響，綜合考慮指標(biāo)成分分離度與峰形，結(jié)合基線平穩(wěn)狀況，最終確定采用Waters CORTECS C18色譜柱，并以乙腈-水(含0.1%磷酸)進(jìn)行梯度洗脫。同時(shí)參考文獻(xiàn)[12-13]結(jié)合二極管陣列檢測(cè)器DAD全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷在230 nm左右均有最大吸收，而且大于260 nm后兩者吸收均較弱；斯皮諾素、槲皮苷分別在260、345 nm左右有較大吸收，綜合考慮峰高，最終選用242 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，此時(shí)各成分峰形、分離度良好，陰性樣品無(wú)干擾，專屬性良好。

3.3 指標(biāo)成分篩選 本實(shí)驗(yàn)選擇芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷作為指標(biāo)成分，均是發(fā)揮抗抑郁、鎮(zhèn)靜催眠的主要活性物質(zhì)[14-16]，這與舒眠膠囊用于治療肝郁傷神所致失眠癥相符。現(xiàn)代藥理研究表明，酸棗仁中以酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B為代表的皂苷類物質(zhì)也為其鎮(zhèn)靜安神的主要藥效成分；柴胡中柴胡皂苷A、柴胡皂苷D等也具有抗抑郁、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥理活性[17-18]，但該類成分在紫外檢測(cè)器上存在末端吸收，基線易漂移，受干擾較嚴(yán)重，故今后將采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定舒眠膠囊中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷的含量，該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，具有良好的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性，可為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和提高奠定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。