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        山楂、決明子、澤瀉提取物對高脂血癥大鼠血脂水平、肝功能及HMGCR表達(dá)的影響

        2021-10-26 12:06:42胡慧明朱彥陳于城安陳笑天鄧雅瓊
        中成藥 2021年10期

        胡慧明, 朱彥陳, 于城安, 袁 斌, 陳笑天, 官 揚, 鄧雅瓊, 邵 峰*

        (1.江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院,江西 南昌 330004;2.江西中醫(yī)藥大學(xué),江西 南昌 330004)

        高脂血癥又稱為血脂異常,是一種中老年人最常見的全身性疾病,它是誘發(fā)脂肪肝、肥胖、高黏血癥、高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病、冠心病及腦卒中等心腦血管疾病的重要危險因素[1-3]。近年來,調(diào)脂中藥受到了廣泛的認(rèn)可與青睞,其特點在于食用安全,作用多途徑、多靶點,藥效溫和,適于長期服用。

        臨床上高脂血癥主要采用益氣健脾、疏肝理氣、補益肝腎等方法治療[4],肝主疏泄,氣機調(diào)暢,有助于脾的運化和升清,是瘀血形成的重要環(huán)節(jié);脾主運化升清,又有助于肝的疏泄升發(fā),為“生痰之源”;腎主水化氣,為先天之本,對五臟的功能具有調(diào)節(jié)作用,調(diào)節(jié)主持全身水液輸布[5],若脾失運化、肝失疏泄、腎失氣化,則氣血運行不暢,津液內(nèi)停,化生膏脂,故應(yīng)從肝、脾、腎辨證入手,通過健脾化痰、祛瘀、滋補肝腎以調(diào)脂[6-7],可更好地提高臨床療效。

        決明子具有清肝明目、滋益肝腎之功效,山楂能健脾開胃、行氣散瘀,澤瀉又可利水滲濕、泄熱通淋,正是從肝脾腎角度論治,均對高血脂癥有明顯的療效[8-10],臨床應(yīng)用廣泛,但三藥合用的調(diào)脂保肝作用及機制尚未見報道。因此,本實驗采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠模擬人類不良飲食習(xí)慣建立高脂血癥模型,考察山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠血脂水平、肝功能及HMGCR表達(dá)的影響,并探討其潛在作用機制。

        1 材料

        1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠40只,體質(zhì)量180~220 g,購于江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,動物生產(chǎn)許可證號SCXK(贛)2018-0003。飼養(yǎng)條件為溫度22~26 ℃,相對濕度60%~70%,每日更換水和飼料。

        1.2 試劑與藥物 山楂提取物(粉末狀,標(biāo)準(zhǔn)水提工藝,即藥材粉碎→投料→水浸泡→提取→濃縮→噴霧干燥→滅菌→過篩→粉末)(批號 ZLSC19010401)、決明子提取物(粉末狀,標(biāo)準(zhǔn)水提工藝,操作同山楂提取物)(批號ZLSC18121003)、澤瀉提取物(粉末狀,標(biāo)準(zhǔn)水提工藝,操作同山楂提取物)(批號ZLSC18101305)均購自南京澤朗生物科技有限公司。辛伐他汀片,購自天津懷仁制藥有限公司(批號20180605)。高脂飼料(豬油10%、膽固醇2%、三號膽鹽1%、蛋黃粉10%),購自南通特洛菲飼料科技有限公司(批號19040106)??偰懝檀?TC)試劑盒(批號 2019011501)、甘油三酯(TG)試劑盒(批號 2018091801)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒(批號 2018091901)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(批號2018082701)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測定試劑盒(批號 2018121103)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測定試劑盒(批號 2018111401),均購自安徽伊普諾康生物科技股份有限公司;羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)抗體,購自南京恩晶生物科技有限公司(批號 H15F07)。

        1.3 儀器 AU480全自動生化分析儀(美國Beckman Coulter公司);Dako CoverStainer組織染色機(丹麥Dako Denmark A/S公司);HI1210攤片機、DM1000生物顯微鏡(德國Leica公司);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)。

        2 方法

        2.1 藥物制備 將3種提取物按1∶1∶1比例混合,蒸餾水分別配制成0.1、0.3 g/mL混懸液;辛伐他汀片給藥前,蒸餾水配制成1 mg/mL混懸液。

        2.2 分組、造模及給藥 將40只大鼠隨機分為正常對照組,模型對照組[根據(jù)2015年版《中國藥典》3味藥材的成人推薦劑量(每天9 g)進(jìn)行動物給藥劑量換算(成人按照60 kg計算,折算成大鼠劑量約為1 g/kg)],山楂、決明子、澤瀉提取物低劑量組(1 g/kg),山楂、決明子、澤瀉提取物高劑量組(3 g/kg),陽性對照組(辛伐他汀,10 mg/kg),每組8只,正常對照組大鼠給予基礎(chǔ)飼料,其他各組大鼠給予高脂飼料[11],實驗期間自由采食飲水,連續(xù)5周。同時,各組大鼠每天灌胃給予相應(yīng)藥物,容量1 mL/100 g,每天1次,連續(xù)5周,正常對照組、模型對照組大鼠灌胃給予相應(yīng)體積的蒸餾水。

        2.3 標(biāo)本采集、指標(biāo)檢測 分別于造模給藥2、5周后,各組大鼠眼眶取血0.8 mL,3 500 r/min離心10 min,取血清,全自動生化儀檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST水平。

        2.4 肝臟病理形態(tài)學(xué)觀察 末次給藥采血完畢后,大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(0.3 mL/100 g)麻醉,解剖取肝臟,甲醛固定,乙醇脫水,石蠟包埋,切片,二甲苯脫蠟,HE染色,中性樹膠封片,在顯微鏡下觀察病理變化,每張病理切片取3個視野進(jìn)行評分[12-13],其中肝細(xì)胞形態(tài)整齊,肝細(xì)胞索排列整齊,肝竇清晰,無脂肪變性,無炎癥細(xì)胞浸潤等病理改變,為0分;肝細(xì)胞索排列紊亂,偶見脂滴空泡,有輕微的炎性浸潤,為1分;肝細(xì)胞有輕度腫脹,較多脂滴空泡和炎性浸潤,為2分;肝竇消失,肝細(xì)胞重度腫脹,有大量脂滴空泡和炎性浸潤,為3分。

        2.5 肝組織HMGCR檢測 采用免疫組化法,在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照,應(yīng)用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件,根據(jù)染色面積和強度進(jìn)行半定量分析,HMGCR平均光密度值=積分光密度(IOD)/面積(Area)。

        3 結(jié)果

        3.1 山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠血脂水平的影響 與正常對照組比較,高脂飼料喂養(yǎng)2、5周后,模型對照組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.01),HDL-C水平降低(P<0.01);與模型對照組比較,給藥2、5周后,山楂、決明子、澤瀉提取物1 g/kg劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.05,P<0.01),HDL-C水平升高(P<0.01);3 g/kg劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.01),HDL-C水平升高(P<0.01);辛伐他汀組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.01),HDL-C水平升高(P<0.01)。見圖1~2。

        注:與正常對照組比較,##P<0.01;與模型對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

        注:與正常對照組比較,##P<0.01;與模型對照組比較,**P<0.01。

        3.2 山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠血清ALT、AST水平的影響 與正常對照組比較,高脂飼料喂養(yǎng)2、5周后,模型對照組大鼠血清ALT、AST水平升高(P<0.01);與模型對照組比較,給藥2、5周后,山楂、決明子、澤瀉提取物1 g/kg劑量組大鼠血清ALT、AST水平降低(P<0.05,P<0.01);3 g/kg劑量組大鼠血清ALT、AST水平降低(P<0.01);辛伐他汀組大鼠血清ALT、AST有降低趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

        注:與正常對照組比較,##P<0.01;與模型對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

        3.3 肝組織病理形態(tài)學(xué)變化 正常對照組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)正常,肝細(xì)胞分界清楚,匯管區(qū)完整清晰,肝細(xì)胞排列緊密整齊,肝竇清晰可見,肝細(xì)胞索呈放射狀排列,肝細(xì)胞多邊形,肝細(xì)胞未見變性;模型對照組大鼠正常肝組織結(jié)構(gòu)消失,肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,細(xì)胞索排列紊亂,大部分肝竇消失,脂滴空泡較多,肝細(xì)胞重度腫脹,出現(xiàn)彌漫性肝細(xì)胞氣球樣變,大量炎性細(xì)胞浸潤;山楂、決明子、澤瀉提取物組大鼠肝組織氣球樣變、腫脹程度減輕,部分肝竇清晰可見,細(xì)胞內(nèi)匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤減輕,范圍明顯減小、辛伐他汀給藥組大鼠脂滴空泡減少,肝組織氣球樣變、腫脹程度減輕,肝細(xì)胞內(nèi)匯管區(qū)偶見部分炎性細(xì)胞浸潤。見表1、圖4。

        表1 山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠肝臟病理評分的影響

        圖4 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)(HE,×200)

        3.4 山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠肝組織HMGCR表達(dá)的影響 正常對照組大鼠偶見肝細(xì)胞胞漿褐色陽性表達(dá);模型對照組大鼠多數(shù)肝細(xì)胞胞漿棕褐色陽性表達(dá);山楂、決明子、澤瀉提取物1 g/kg劑量組大鼠部分肝細(xì)胞胞漿淡褐色陽性表達(dá);3 g/kg劑量組、辛伐他汀組大鼠少數(shù)肝細(xì)胞胞漿淡褐色陽性表達(dá)。與正常對照組比較,模型對照組大鼠HMGCR陽性表達(dá)升高(P<0.01);與模型對照組比較,各用藥組HMGCR陽性表達(dá)下降(P<0.01)。見表2、圖5。

        表2 山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠肝組織HMGCR表達(dá)的影響

        圖5 各組大鼠肝組織HMGCR表達(dá)(免疫組化,×200)

        4 討論

        高脂血癥是指血液中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)增高,而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低[14],該病臨床表現(xiàn)為高膽固醇血癥,高甘油三脂血癥或兩者兼有(混合型高脂血癥)。

        中醫(yī)認(rèn)為,高脂血癥乃因肝脾腎三臟功能失調(diào)[4],病機主要是由于脾腎虛損,肝失疏泄,從而導(dǎo)致全身氣機升降失常,水液代謝障礙,致使氣滯血瘀,痰濁內(nèi)生、濁陰不用,化為膏脂,進(jìn)而導(dǎo)致高脂血癥的產(chǎn)生[15]。山楂、決明子、澤瀉提取物中山楂具有健脾開胃、行氣散瘀之功效,決明子能清肝明目、滋益肝腎,澤瀉具有利水滲濕、泄熱通淋之功效,三者合用,整體調(diào)節(jié),共奏肝脾腎三臟同治之效。本研究結(jié)果顯示,山楂、決明子、澤瀉提取物能改善高脂血癥模型大鼠血脂水平,降低血清TC、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平;同時還能降低ALT、AST水平,并減輕肝組織氣球樣變、腫脹程度,改善炎癥細(xì)胞浸潤。提示其具有一定的調(diào)脂保肝作用。

        體內(nèi)獲得膽固醇的兩條途徑是肝臟膽固醇的內(nèi)源性自身合成以及小腸從食物中的吸收,其中肝臟合成的膽固醇是機體膽固醇最主要的來源。HMGCR是肝臟合成膽固醇的限速酶[16-17],HMGCR表達(dá)上調(diào)則體內(nèi)膽固醇合成增多,臨床上他汀類藥物是通過抑制HMGCR活性來產(chǎn)生降血脂作用的[18]。因此,抑制HMGCR則能減少體內(nèi)膽固醇的合成,從而調(diào)節(jié)血脂代謝。本研究結(jié)果顯示,與模型對照組比較,山楂、決明子、澤瀉提取物不同劑量組大鼠肝組織HMGCR表達(dá)明顯下調(diào),提示其可能是山楂、決明子、澤瀉提取物產(chǎn)生調(diào)血脂作用的重要靶點。

        綜上所述,山楂、決明子、澤瀉提取物從肝脾腎同治角度能降低高脂血癥模型大鼠血脂水平,改善肝功能,減輕肝臟脂肪變性,其作用機制可能是與下調(diào)HMGCR表達(dá)有關(guān),但也可能存在其他作用靶點,有待進(jìn)一步研究。同時三藥合用在臨床選藥與用藥劑量方面也起到了一定的指導(dǎo)作用,將為臨床防治高脂血癥提供客觀依據(jù)和新思路。

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