胡慧明， 朱彥陳， 于城安， 袁 斌， 陳笑天， 官 揚， 鄧雅瓊， 邵 峰*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院，江西 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004)

高脂血癥又稱為血脂異常，是一種中老年人最常見的全身性疾病，它是誘發(fā)脂肪肝、肥胖、高黏血癥、高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病、冠心病及腦卒中等心腦血管疾病的重要危險因素[1-3]。近年來，調(diào)脂中藥受到了廣泛的認(rèn)可與青睞，其特點在于食用安全，作用多途徑、多靶點，藥效溫和，適于長期服用。

臨床上高脂血癥主要采用益氣健脾、疏肝理氣、補益肝腎等方法治療[4]，肝主疏泄，氣機調(diào)暢，有助于脾的運化和升清，是瘀血形成的重要環(huán)節(jié)；脾主運化升清，又有助于肝的疏泄升發(fā)，為“生痰之源”；腎主水化氣，為先天之本，對五臟的功能具有調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)主持全身水液輸布[5]，若脾失運化、肝失疏泄、腎失氣化，則氣血運行不暢，津液內(nèi)停，化生膏脂，故應(yīng)從肝、脾、腎辨證入手，通過健脾化痰、祛瘀、滋補肝腎以調(diào)脂[6-7]，可更好地提高臨床療效。

決明子具有清肝明目、滋益肝腎之功效，山楂能健脾開胃、行氣散瘀，澤瀉又可利水滲濕、泄熱通淋，正是從肝脾腎角度論治，均對高血脂癥有明顯的療效[8-10]，臨床應(yīng)用廣泛，但三藥合用的調(diào)脂保肝作用及機制尚未見報道。因此，本實驗采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠模擬人類不良飲食習(xí)慣建立高脂血癥模型，考察山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠血脂水平、肝功能及HMGCR表達(dá)的影響，并探討其潛在作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g，購于江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(贛)2018-0003。飼養(yǎng)條件為溫度22～26 ℃，相對濕度60%～70%，每日更換水和飼料。

1.2 試劑與藥物 山楂提取物(粉末狀，標(biāo)準(zhǔn)水提工藝，即藥材粉碎→投料→水浸泡→提取→濃縮→噴霧干燥→滅菌→過篩→粉末)(批號 ZLSC19010401)、決明子提取物(粉末狀，標(biāo)準(zhǔn)水提工藝，操作同山楂提取物)(批號ZLSC18121003)、澤瀉提取物(粉末狀，標(biāo)準(zhǔn)水提工藝，操作同山楂提取物)(批號ZLSC18101305)均購自南京澤朗生物科技有限公司。辛伐他汀片，購自天津懷仁制藥有限公司(批號20180605)。高脂飼料(豬油10%、膽固醇2%、三號膽鹽1%、蛋黃粉10%)，購自南通特洛菲飼料科技有限公司(批號19040106)?？偰懝檀?TC)試劑盒(批號 2019011501)、甘油三酯(TG)試劑盒(批號 2018091801)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒(批號 2018091901)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(批號2018082701)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測定試劑盒(批號 2018121103)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測定試劑盒(批號 2018111401)，均購自安徽伊普諾康生物科技股份有限公司；羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)抗體，購自南京恩晶生物科技有限公司(批號 H15F07)。

1.3 儀器 AU480全自動生化分析儀(美國Beckman Coulter公司)；Dako CoverStainer組織染色機(丹麥Dako Denmark A/S公司)；HI1210攤片機、DM1000生物顯微鏡(德國Leica公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)。

2 方法

2.1 藥物制備 將3種提取物按1∶1∶1比例混合，蒸餾水分別配制成0.1、0.3 g/mL混懸液；辛伐他汀片給藥前，蒸餾水配制成1 mg/mL混懸液。

2.2 分組、造模及給藥 將40只大鼠隨機分為正常對照組，模型對照組[根據(jù)2015年版《中國藥典》3味藥材的成人推薦劑量(每天9 g)進(jìn)行動物給藥劑量換算(成人按照60 kg計算，折算成大鼠劑量約為1 g/kg)]，山楂、決明子、澤瀉提取物低劑量組(1 g/kg)，山楂、決明子、澤瀉提取物高劑量組(3 g/kg)，陽性對照組(辛伐他汀，10 mg/kg)，每組8只，正常對照組大鼠給予基礎(chǔ)飼料，其他各組大鼠給予高脂飼料[11]，實驗期間自由采食飲水，連續(xù)5周。同時，各組大鼠每天灌胃給予相應(yīng)藥物，容量1 mL/100 g，每天1次，連續(xù)5周，正常對照組、模型對照組大鼠灌胃給予相應(yīng)體積的蒸餾水。

2.3 標(biāo)本采集、指標(biāo)檢測 分別于造模給藥2、5周后，各組大鼠眼眶取血0.8 mL，3 500 r/min離心10 min，取血清，全自動生化儀檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST水平。

2.4 肝臟病理形態(tài)學(xué)觀察 末次給藥采血完畢后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(0.3 mL/100 g)麻醉，解剖取肝臟，甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，HE染色，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察病理變化，每張病理切片取3個視野進(jìn)行評分[12-13]，其中肝細(xì)胞形態(tài)整齊，肝細(xì)胞索排列整齊，肝竇清晰，無脂肪變性，無炎癥細(xì)胞浸潤等病理改變，為0分；肝細(xì)胞索排列紊亂，偶見脂滴空泡，有輕微的炎性浸潤，為1分；肝細(xì)胞有輕度腫脹，較多脂滴空泡和炎性浸潤，為2分；肝竇消失，肝細(xì)胞重度腫脹，有大量脂滴空泡和炎性浸潤，為3分。

2.5 肝組織HMGCR檢測 采用免疫組化法，在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件，根據(jù)染色面積和強度進(jìn)行半定量分析，HMGCR平均光密度值=積分光密度(IOD)/面積(Area)。

3 結(jié)果

3.1 山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠血脂水平的影響 與正常對照組比較，高脂飼料喂養(yǎng)2、5周后，模型對照組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.01)，HDL-C水平降低(P<0.01)；與模型對照組比較，給藥2、5周后，山楂、決明子、澤瀉提取物1 g/kg劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.05,P<0.01)，HDL-C水平升高(P<0.01)；3 g/kg劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.01)，HDL-C水平升高(P<0.01)；辛伐他汀組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.01)，HDL-C水平升高(P<0.01)。見圖1～2。

注：與正常對照組比較，##P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：與正常對照組比較，##P<0.01；與模型對照組比較，**P<0.01。

3.2 山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠血清ALT、AST水平的影響 與正常對照組比較，高脂飼料喂養(yǎng)2、5周后，模型對照組大鼠血清ALT、AST水平升高(P<0.01)；與模型對照組比較，給藥2、5周后，山楂、決明子、澤瀉提取物1 g/kg劑量組大鼠血清ALT、AST水平降低(P<0.05,P<0.01)；3 g/kg劑量組大鼠血清ALT、AST水平降低(P<0.01)；辛伐他汀組大鼠血清ALT、AST有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

注：與正常對照組比較，##P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 肝組織病理形態(tài)學(xué)變化 正常對照組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)正常，肝細(xì)胞分界清楚，匯管區(qū)完整清晰，肝細(xì)胞排列緊密整齊，肝竇清晰可見，肝細(xì)胞索呈放射狀排列，肝細(xì)胞多邊形，肝細(xì)胞未見變性；模型對照組大鼠正常肝組織結(jié)構(gòu)消失，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞索排列紊亂，大部分肝竇消失，脂滴空泡較多，肝細(xì)胞重度腫脹，出現(xiàn)彌漫性肝細(xì)胞氣球樣變，大量炎性細(xì)胞浸潤；山楂、決明子、澤瀉提取物組大鼠肝組織氣球樣變、腫脹程度減輕，部分肝竇清晰可見，細(xì)胞內(nèi)匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤減輕，范圍明顯減小、辛伐他汀給藥組大鼠脂滴空泡減少，肝組織氣球樣變、腫脹程度減輕，肝細(xì)胞內(nèi)匯管區(qū)偶見部分炎性細(xì)胞浸潤。見表1、圖4。

表1 山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠肝臟病理評分的影響

圖4 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)(HE，×200)

3.4 山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠肝組織HMGCR表達(dá)的影響 正常對照組大鼠偶見肝細(xì)胞胞漿褐色陽性表達(dá)；模型對照組大鼠多數(shù)肝細(xì)胞胞漿棕褐色陽性表達(dá)；山楂、決明子、澤瀉提取物1 g/kg劑量組大鼠部分肝細(xì)胞胞漿淡褐色陽性表達(dá)；3 g/kg劑量組、辛伐他汀組大鼠少數(shù)肝細(xì)胞胞漿淡褐色陽性表達(dá)。與正常對照組比較，模型對照組大鼠HMGCR陽性表達(dá)升高(P<0.01)；與模型對照組比較，各用藥組HMGCR陽性表達(dá)下降(P<0.01)。見表2、圖5。

表2 山楂、決明子、澤瀉提取物對大鼠肝組織HMGCR表達(dá)的影響

圖5 各組大鼠肝組織HMGCR表達(dá)(免疫組化，×200)

4 討論

高脂血癥是指血液中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)增高，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低[14]，該病臨床表現(xiàn)為高膽固醇血癥，高甘油三脂血癥或兩者兼有(混合型高脂血癥)。

中醫(yī)認(rèn)為，高脂血癥乃因肝脾腎三臟功能失調(diào)[4]，病機主要是由于脾腎虛損，肝失疏泄，從而導(dǎo)致全身氣機升降失常，水液代謝障礙，致使氣滯血瘀，痰濁內(nèi)生、濁陰不用，化為膏脂，進(jìn)而導(dǎo)致高脂血癥的產(chǎn)生[15]。山楂、決明子、澤瀉提取物中山楂具有健脾開胃、行氣散瘀之功效，決明子能清肝明目、滋益肝腎，澤瀉具有利水滲濕、泄熱通淋之功效，三者合用，整體調(diào)節(jié)，共奏肝脾腎三臟同治之效。本研究結(jié)果顯示，山楂、決明子、澤瀉提取物能改善高脂血癥模型大鼠血脂水平，降低血清TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平；同時還能降低ALT、AST水平，并減輕肝組織氣球樣變、腫脹程度，改善炎癥細(xì)胞浸潤。提示其具有一定的調(diào)脂保肝作用。

體內(nèi)獲得膽固醇的兩條途徑是肝臟膽固醇的內(nèi)源性自身合成以及小腸從食物中的吸收，其中肝臟合成的膽固醇是機體膽固醇最主要的來源。HMGCR是肝臟合成膽固醇的限速酶[16-17]，HMGCR表達(dá)上調(diào)則體內(nèi)膽固醇合成增多，臨床上他汀類藥物是通過抑制HMGCR活性來產(chǎn)生降血脂作用的[18]。因此，抑制HMGCR則能減少體內(nèi)膽固醇的合成，從而調(diào)節(jié)血脂代謝。本研究結(jié)果顯示，與模型對照組比較，山楂、決明子、澤瀉提取物不同劑量組大鼠肝組織HMGCR表達(dá)明顯下調(diào)，提示其可能是山楂、決明子、澤瀉提取物產(chǎn)生調(diào)血脂作用的重要靶點。

綜上所述，山楂、決明子、澤瀉提取物從肝脾腎同治角度能降低高脂血癥模型大鼠血脂水平，改善肝功能，減輕肝臟脂肪變性，其作用機制可能是與下調(diào)HMGCR表達(dá)有關(guān)，但也可能存在其他作用靶點，有待進(jìn)一步研究。同時三藥合用在臨床選藥與用藥劑量方面也起到了一定的指導(dǎo)作用，將為臨床防治高脂血癥提供客觀依據(jù)和新思路。