丁元元， 趙 霞*， 邢瓊瓊， 董盈妹， 紀建建， 梁眾擎

[1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)兒科研究所，江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點實驗室，江蘇 南京 210023]

兒童變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)屬中醫(yī)“鼻鼽”范疇，是一種以突然鼻癢、打噴嚏、流涕和鼻塞為主要臨床表現(xiàn)的過敏性疾病，其對小兒生活質(zhì)量、成長健康及心理狀態(tài)的負面影響持久而深遠[1]。兒童過敏性疾病的負擔已成為醫(yī)療保健系統(tǒng)面臨的主要挑戰(zhàn)之一[2]。近年變應性鼻炎日趨成為兒童主要的呼吸道慢性疾病[3]，由于兒童自身的特性，變應性鼻炎的鼻塞癥狀難以持久改善，對患兒的成長及頜面部發(fā)育會產(chǎn)生終身影響[4]，現(xiàn)西藥治療變應性鼻炎以類固醇制劑、抗組胺類藥物和白三烯抑制劑為主，有作用靶點單一、療效短暫、副作用較多缺陷。中國的兒科人群中使用中藥的比例很高[5]，大量的臨床研究已經(jīng)證明中醫(yī)藥治療變應性鼻炎安全有效[6]，中醫(yī)藥對癥治療獨具優(yōu)勢。鼻敏通竅方在臨床應用多年，其療效穩(wěn)定、持久，尤可長效改善鼻塞癥狀，臨床療效顯著。本實驗通過建立變應性鼻炎動物模型，從免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)和嗜酸性粒細胞(eosinophil，EOS)的角度，初步探討鼻敏通竅方治療小兒變應性鼻炎的作用機理。

1 材料

1.1 動物 BALB/c小鼠50只，體質(zhì)量18～22 g，雌性，SPF級，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2017-0001。

1.2 藥物 鼻敏通竅方，由蒼耳子6 g、辛夷6 g(包煎)、川芎6 g、白芷10 g、防風6 g、白芍10 g、烏梅10 g、生石膏15 g組成，由北京同仁堂有限公司南京店提供，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室劉圣金副教授鑒定為正品，藥材依次加8、6倍量水浸泡1 h后煮沸2次，每次約30 min，過濾后并濃縮濾液至2 g/mL，裝于無菌瓶中，置于4 ℃冰箱中冷藏備用。孟魯司特鈉顆粒，購自杭州默沙東制藥有限公司，批號J20140167，蒸餾水溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 儀器 ELX800酶標儀，購自美國BioTek公司；電子分析天平(CPA2250)，購自德國Sartorius公司；-80 ℃超低溫冰箱，購自美國Thermo公司；移液器，購自德國Eppendorf公司；恒溫振蕩儀(THZ-C)，購自太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機，購自德國Eppendorf公司；Accuri C6 Plus流式細胞計數(shù)儀，購自美國BD公司。

1.4 試劑 氫氧化鋁凝膠，購自西安赫特科技有限公司；卵清蛋白(OVA grade V)，購自美國Sigma公司；小鼠外周血淋巴細胞分離液，購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，批號LTS1092-200；流式熒光表面抗體CD11C-FITC、Siglec-F-APC(鼠抗)，購自美國eBioscience公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，購自上海源培生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 50只小鼠適應性飼養(yǎng)3 d后，隨機分為空白組(8只)、模型組(8只)、孟魯司特鈉組(8只)、鼻敏通竅方低劑量組(8只)、鼻敏通竅方中劑量組(9只)，鼻敏通竅方高劑量組(9只)，參考文獻[7]報道建立小鼠變應性鼻炎模型。除空白組外，各組小鼠在第0、7、14天腹腔注射0.2 mL致敏液(含OVA 40 μg、氫氧化鋁凝膠1.5 mg，溶于生理鹽水中)，第21天雙側(cè)滴鼻OVA溶液(含200 μg OVA)40 μL/只，連續(xù)7 d，正常組小鼠以同體積0.9%氯化鈉溶液代替。每次滴鼻激發(fā)5 h后，空白組，模型組，鼻敏通竅方高、中、低劑量組(2、1.5、1 g/mL)，孟魯司特鈉組(1.35 mg/kg)小鼠每天灌胃給藥1次，共7 d。

2.2 樣品制備 小鼠末次灌胃給藥、禁食不禁水24 h后，摘除眼球取血，3 000 r/min離心10 min，取上清保存于-80 ℃冰箱中，外周血加入小鼠淋巴細胞分離液，梯度離心法分離收集PBMC。脫頸椎處死小鼠，取鼻黏膜組織，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，病理切片進行HE染色。

2.3 指標檢測 ELISA法檢測小鼠血清中IgE水平，相關(guān)試劑盒由杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司提供，操作嚴格按要求進行。分離出的PBMC用PBS緩沖液洗滌，離心，重懸，加入流式熒光抗體Siglec-F-APC，CD11c-FITC標記，篩網(wǎng)過濾后5 min內(nèi)上機檢測，分析EOS比例。

3 結(jié)果

3.1 行為學評分 在小鼠末次鼻腔激發(fā)致敏后立即觀察30 min，記錄噴嚏、流涕、抓鼻情況，疊加量化計分法計分，總分超過5分表示造模成功，評分標準[8]見表1，結(jié)果見圖1。由此可知，模型組小鼠癥狀行為學評分高于空白組(P<0.05)，孟魯司特鈉組、鼻敏通竅方組小鼠癥狀行為學評分低于模型組(P<0.05)。

表1 行為學評分標準

3.2 小鼠鼻黏膜病理學變化

3.2.1 鼻黏膜組織病理學評分 由病理讀片工作人員隨機觀察各組4個高倍視野下EOS、肥大細胞等炎性細胞、纖毛、杯狀細胞情況，以及黏膜下層腺體肥大、增生程度及黏膜上皮完整性，并進行分級評分，評定標準見表2，結(jié)果見圖2。由此可知，模型組顯示病理評分高于空白組(P<0.05)，孟魯司特鈉組、鼻敏通竅方中劑量組小鼠病理評分低于模型組(P<0.05)。

注：與空白組比較， #P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

表2 鼻黏膜組織病理學評分標準

3.2.2 鼻黏膜組織HE染色及EOS計數(shù) 與空白組比較，模型組小鼠鼻黏膜纖毛柱狀上皮細胞排列紊亂，缺乏完整性，纖毛大量脫落，固有層腺體增生明顯，并伴有大量炎性細胞的滲出；與模型組比較，鼻敏通竅方組小鼠纖毛柱狀上皮細胞排列整齊，偶有脫落，有少量炎性滲出，而孟魯司特鈉組小鼠可見上皮細胞脫落，腺體增生，有少量炎性滲出，見圖3A。隨機選取3個不同視野(HE，×400)觀察，發(fā)現(xiàn)模型組EOS計數(shù)高于空白組(P<0.05)；孟魯司特鈉組、鼻敏通竅方組EOS計數(shù)低于模型組(P<0.05)，見圖3B。

注：黃色箭頭處為大量性細胞浸潤，紅色箭頭處為固有層腺體增生，黑色箭頭處為上皮細胞脫落。與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3.3 小鼠外周血IgE表達 模型組小鼠IgE表達高于空白組(P<0.05)，孟魯司特鈉組、鼻敏通竅方組小鼠IgE表達低于模型組(P<0.05)，見圖4。

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3.4 小鼠PBMC中EOS比例 模型組小鼠EOS比例高于空白組(P<0.05)，鼻敏通竅方組小鼠EOS比例低于模型組(P<0.05)，見圖5。

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

4 討論

變應性鼻炎是兒童最常見的過敏性疾病之一。主要由IgE介導，即特應性個體吸入過敏原后，過激產(chǎn)生IgE抗體，與各類免疫細胞如EOS、肥大細胞等表面抗體結(jié)合，使免疫細胞過度活化，致機體處于致敏狀態(tài)，釋放多種炎性介質(zhì)，而導致鼻黏膜非感染性慢性炎性浸潤[6]。多年相關(guān)研究證實IgE是過敏反應的核心介導，總IgE增加已經(jīng)成為AR主要的診斷標準和治療靶標[9]。

AR是一種以Th2過度分化為主的鼻黏膜免疫疾病，Th2細胞因子的過量產(chǎn)生和鼻黏膜組織中與過敏相關(guān)促炎細胞的大量浸潤，導致機體免疫調(diào)節(jié)功能異常[10]。AR存在速發(fā)相和遲發(fā)相反應，鼻塞在兩者中都是顯著的癥狀[11]。鼻腔黏膜在過敏原反復刺激下，肥大細胞和EOS等炎性細胞聚集鼻腔，導致黏膜腫脹[12]。EOS在變應性鼻炎的生理病理中起著重要的作用[13]，是人類過敏性疾病中重要的效應細胞，可釋放促炎介質(zhì)，在過敏性鼻炎患者的血常規(guī)中，EOS數(shù)量升高[14]。鼻黏膜EOS積累是導致鼻腔黏膜慢性持續(xù)炎癥的重要因素。近年研究發(fā)現(xiàn)，EOS是一種多功能的白細胞，它參與維持組織的動態(tài)平衡、調(diào)節(jié)針對特定微生物的適應性和固有免疫應答[15]。變應性疾病的抗原呈遞細胞不僅激活Th2細胞，也分泌促炎癥反應介質(zhì)，這些因子可誘發(fā)上皮細胞產(chǎn)生趨化因子吸引EOS[16]。

祖國醫(yī)學很早就已經(jīng)認識到AR的發(fā)病與自然環(huán)境、氣候、人體存在密切的關(guān)系，中醫(yī)認為小兒鼻鼽的發(fā)病，除冒受外風、異氣，伏風內(nèi)潛之外，還與患兒肺、脾、腎三臟功能失調(diào)密切相關(guān)[17]。其病理因素主要為風和痰。小兒肺常不足，氣候交替，環(huán)境改變之時，異稟質(zhì)小兒因風邪侵襲而肺失宣降，津液失布；小兒脾常不足，易聚濕為痰；小兒腎常不足，痰根難祛，而致風痰博結(jié)，阻礙津液正常運化，使其發(fā)生代謝異常，因此出現(xiàn)鼻癢，噴嚏，流涕，鼻塞反復發(fā)作無常。鼻敏通竅方主要由蒼耳子、辛夷、川芎、白芷、防風、白芍、烏梅、生石膏組成。方中蒼耳子、辛夷、白芷有辛陽發(fā)散、宣風通竅之功；川芎辛溫香竄，活血行氣，祛風止痛，可除久病留瘀，祛風同時配伍活血之藥，取“治風先治血，血行風自滅”之意，以利風邪消散；白芍、烏梅能滋陰和營，斂津澀涕，又防辛溫之藥發(fā)散太過而耗傷小兒氣津；防風為風中潤劑，性甘潤，既能祛風發(fā)表止癢，宣肺氣，又有升陽運脾化痰之功，與烏梅組成藥對，祛風抗過敏[18]，甘酸斂肺生津，可順接臟腑陰陽之氣；生石膏清肺之郁熱。全方祛風行氣化痰，驅(qū)邪不傷津，斂液不留邪，平衡小兒陰陽。全方配伍根據(jù)小兒用藥特點，遵從中醫(yī)整體觀念和辨證施治原則，謹守病機，標本兼顧，共奏祛風化痰通竅之效，在臨床上獲得了持久而顯著的療效。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，變應性鼻炎小鼠模型體內(nèi)IgE維持高水平狀態(tài)，而循環(huán)EOS也呈現(xiàn)高表達；變應性鼻炎模型組小鼠鼻黏膜纖毛柱狀上皮細胞結(jié)構(gòu)破壞嚴重，而鼻敏通竅方組小鼠鼻黏膜上皮細胞結(jié)構(gòu)的破壞有所改善。這些結(jié)果表明，小兒變應性鼻炎慢性炎癥持續(xù)存在，鼻敏通竅方能夠下調(diào)IgE的合成，減少EOS的浸潤，維護鼻黏膜纖毛柱狀上皮細胞的完整性，而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)效應，改善鼻部慢性炎癥，減輕變應性鼻炎的發(fā)作?；诒敬螌嶒灲Y(jié)果，下一步擬采用分子生物學技術(shù)，從EOS過度活化的角度出發(fā)，篩選出能影響EOS活化的趨化因子，進一步揭示鼻敏通竅方對兒童變應性鼻炎治療的作用機理，開拓中醫(yī)藥防治小兒變應性鼻炎的新思路。