黃麗平， 周中流， 寧百樂， 張芹欣， 鄧敏貞*

(1.嶺南師范學院，廣東 湛江 524048；2.廣東省中醫(yī)院，廣東省中醫(yī)藥科學院，廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510120)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是常見的神經退行性疾病，臨床表現為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩、姿勢不穩(wěn)，其主要病理特點為中腦黑質多巴胺能神經元嚴重缺失和紋狀體多巴胺(DA)神經遞質的急劇下降[1]，發(fā)病前期可用左旋多巴(L-dopa)治療，但在2～5年后療效逐漸不明顯，并且后期會出現癥狀波動與異動癥，是相關治療的最大難題[2]。研究表明，石菖蒲揮發(fā)油有效成分β-細辛醚具有一定的神經藥理作用[3]，課題組前期發(fā)現該成分聯合L-dopa后可改善帕金森病大鼠行為障礙[4]，還能調節(jié)血腦屏障相關蛋白表達[5]，但聯合用藥作用機制尚不明確。因此，本實驗著重探討β-細辛醚聯合L-dopa用藥對帕金森病大鼠單胺類神經遞質水平的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 石菖蒲購自廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，經廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部唐洪梅主任鑒定為正品。左旋多巴片(批號19130501，上海福達制藥有限公司)；美多巴(批號SH1609，上海羅氏制藥有限公司)；6-羥基多巴(6-OHDA)(批號H116)、阿撲嗎啡(APO)(批號100839-20060)(美國Sigma公司)。酪氨酸羥化酶(TH)、兒茶酚氧位甲基轉移酶(COMT)ELISA試劑盒(批號12/2018)(上海繼錦化學科技有限公司)；DDC抗體(貨號ab3905)、GAPDH抗體(貨號ab8245)(英國Abcam公司)；羊抗兔抗體(貨號CW0114)、羊抗鼠抗體(貨號CW0113)(北京康為世紀生物科技有限公司)；ECL試劑盒(美國Bio-Rad公司)。

1.2 儀器 Multiskan MK3 酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)； AE-200型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；Waters-200型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；ZB-200 疲勞轉棒儀(成都泰盟科技有限公司)；腦立體定位儀(美國Stoelting公司)；ARATHON牙科鉆(韓國Saeyang公司)；電泳裝置和轉膜裝置(美國Bio-Rad公司)。

1.3 動物 無特定病原體級SD大鼠，100只，雌雄各半，體質量220～250 g，購自廣州中醫(yī)藥大學，實驗動物生產許可證號SCXK(粵)2008-0020，適應環(huán)境3 d后進行實驗。

1.4 β-細辛醚制備 按照2015年版《中國藥典》一部附錄揮發(fā)油提取方法提取石菖蒲揮發(fā)油，得率大于1%，采用冷凍結晶法將其進行純分，得到白色晶體，即為β-細辛醚，通過GC-MS檢測證實其純度在99%以上[6]。

1.5 造模 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，將其頭部固定于腦立體定位儀上，定位于大鼠左腦的前腦內側束(MFB)(AP-4.4 mm，ML-1.2 mm，DV-7.8 mm)，注射6 μL 6-OHDA(4 mg/mL)，注射速度為0.5 μL/min，注射完畢留針15 min，緩慢取出微量注射器，假手術組同法注射含0.02%抗壞血酸的生理鹽水。造模1個月后，大鼠腹腔注射0.5 mg/kg阿撲嗎啡，以向健側旋轉數大于7圈/min為造模成功。

1.6 分組 將70只造模大鼠隨機分為7組，每組10只，雌雄各半，分別為模型組，美多巴組(75 mg/kg)，L-dopa組(60 mg/kg)，β-細辛醚組(15 mg/kg)，聯合低、中、高劑量組[L-dopa 60 mg/kg+ β-細辛醚(7.5、15、30 mg/kg)]，灌胃給藥，正常組、模型組大鼠按0.5 mL/kg劑量灌胃給予蒸餾水，每天2次，持續(xù)30 d。

1.7 指標檢測

1.7.1 大鼠腦組織和血漿中單胺類神經遞質水平 各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后打開腹腔，分離腹主動脈，一次性注射器取動脈血，置于相應編號含肝素鈉的采血管中，3 500 r/min離心20 min，取上清液(血漿)置于相應編號的離心管中，在-20 ℃下保存。打開大鼠胸腔，0.9%生理鹽水灌注心臟至肺完全變白為止，開顱取腦，分離造模側的紋狀體，置于相應編號的離心管中，在-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

取血漿500 μL至相應編號的離心管中，按1∶1比例加入500 μL 5%高氯酸，渦旋混勻，離心(14 000 r/min，4 ℃)10 min，上清液過濾后置于相應編號的樣品瓶中，在4 ℃下待測。將造模側的紋狀體按1∶5比例加入5%高氯酸，電動勻漿，離心(14 000 r/min，4 ℃)10 min，上清液過濾后置于相應編號的樣品瓶中，在4 ℃下待測。分析條件為ODS2色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相0.1 mol/L KH2PO4-甲醇(80∶20)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃，檢測L-dopa、多巴胺(DA)、高香草酸(HVA)、3,4-二羥基苯乙酸(DOPAC)、5-羥色胺(5-HT)水平。

1.7.2 ELISA檢測紋狀體和血漿中酪氨酸羥化酶(TH)、兒茶酚氧位甲基轉移酶(COMT)活性 將大鼠紋狀體按1∶5比例加入0.9%生理鹽水，電動勻漿，離心(14 000 r/min，4 ℃)，上清液過濾后置于相應編號的樣品瓶中，在4 ℃下待測。嚴格按照ELISA說明書操作步驟，檢測大鼠紋狀體和血漿中TH、COMT水平。

1.7.3 Western blot法檢測DDC表達 大鼠紋狀體組織冷凍勻漿后，4 ℃、14 000 r/min離心一段時間，上清液經BCA法定量，上樣量為50 μg，電泳條件為110 V、60 min，濕法轉膜，條件為200 mA、60 min，DDC一抗?jié)舛?∶1 000，二抗?jié)舛?∶2 000，其他操作步驟同常規(guī)Western blot法，采用ECL試劑盒在化學發(fā)光檢測器中檢測，采用Image-pro軟件分析。

2 結果

2.1 大鼠紋狀體中單胺類神經遞質水平 與假手術組比較，模型組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，美多巴組、聯合各劑量組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平升高(P<0.05，P<0.01)，L-dopa組、β-細辛醚組DA、DOPAC、HVA、5-HT水平亦然(P<0.05)；與L-dopa組比較，美多巴組、聯合高劑量組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平升高(P<0.05，P<0.01)，β-細辛醚組DA、DOPAC、HVA水平降低(P<0.05)，聯合低、中劑量組L-dopa水平升高(P<0.01)；與美多巴組比較，β-細辛醚組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平降低(P<0.05，P<0.01)；聯合低劑量組L-dopa、DA、DOPAC、HVA及聯合中劑量組L-dopa、DOPAC、HVA水平降低(P<0.05，P<0.01)，聯合高劑量組L-dopa水平亦然(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠紋狀體中單胺類神經遞質水平

2.2 大鼠血漿中單胺類神經遞質水平 與假手術組比較，模型組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，美多巴組、L-dopa組、β-細辛醚組、聯合各劑量組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平升高(P<0.05，P<0.01)；與L-dopa組比較，美多巴組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平升高(P<0.05，P<0.01)，β-細辛醚組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平降低(P<0.05，P<0.01)。聯合各劑量組L-dopa、DOPAC、HVA水平降低(P<0.05，P<0.01)，而DA、5-HT水平升高(P<0.05)；與美多巴組比較，β-細辛醚組L-dopa、DA、DOPAC、HVA、5-HT水平降低(P<0.05，P<0.01)，聯合各劑量組L-dopa、DOPAC、HVA水平亦然(P<0.05，P<0.01)，而DA水平升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血漿中單胺類神經遞質水平

2.3 大鼠紋狀體和血漿中相關酶活性

2.3.1 紋狀體 與假手術組比較，模型組COMT、TH活性降低(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組COMT、TH活性升高(P<0.05，P<0.01)；與L-dopa組比較，美多巴組和聯合中、高劑量組COMT、TH活性升高(P<0.05)，β-細辛醚組TH活性亦然(P<0.01)；與美多巴組比較，β-細辛醚組、聯合低劑量組COMT、TH活性降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠紋狀體和血漿中相關酶活性

2.3.2 血漿 與假手術組比較，模型組COMT、TH活性降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組COMT、TH活性均升高(P<0.05，P<0.01)；與L-dopa組比較，美多巴組、聯合中高劑量組COMT、TH活性升高(P<0.05)，而β-細辛醚組COMT活性降低(P<0.05)；與美多巴組比較，β-細辛醚組、聯合低劑量組TH活性降低(P<0.05)，見表3。

2.4 大鼠紋狀體中DDC表達 與假手術組比較，模型組DDC表達降低(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組DDC表達升高(P<0.05)；與美多巴組、L-dopa組比較，β-細辛醚組、聯合用藥各劑量組DDC表達升高(P<0.05)，見圖1。

注：A為假手術組，B為模型組，C為美多巴組，D為左旋多巴組，E為β-細辛醚組，F為聯合低劑量組，G為聯合中劑量組，H為聯合高劑量組。與假手術組比較，@@P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與L-dopa組比較，#P<0.05，##P<0.01；與美多巴組比較，&P<0.05，&&P<0.01。

3 討論

多巴胺替代療法可改善帕金森病癥狀但不能阻止這種神經退化的進程[7]。目前，DA的前體藥物L-dopa是DA替代療法的典型代表藥物，是帕金森病治療最有效的藥物，可以改善PD患者的生活質量[8]。但長期單一應用L-dopa在帕金森治療中會產生嚴重不良反應[9]。美多巴(L-dopa+芐絲肼)被稱為“黃金標準”在帕金森病治療，可提高腦中L-dopa水平，從而提高DA水平[10]。然而，美多巴也會產生運動障礙等副作用[11]。前期研究發(fā)現β-細辛醚容易透過血腦屏障和廣泛分布在大腦[12]。它具有中樞神經藥理作用[13]。它還可以減弱自噬的調節(jié)物p-JNK、Bcl-2和Beclin-1，減少6-OHDA所致的腦損傷[14]。這提示β-細辛醚可能有助于PD減輕多巴胺能神經元損傷。

美多巴依賴于L-dopa來維持紋狀體DA水平從而治療帕金森[15]。關鍵是芐絲肼可以抑制L-dopa在外周血脫羧和促進L-dopa部分傳遞到BBB的過程[16]。本研究結果表明，聯合各劑量組紋狀體的L-dopa水平遠低于美多巴組，但聯合高劑量組紋狀體DA水平與美多巴組相當。L-dopa轉化為DA只有通過DDC酶的脫羧作用[17]。此外，β-細辛醚組和聯合各劑量組紋狀體中DDC的表達高于其他治療組。因此，推斷β-細辛醚可能增強DDC的活性。TH是兒茶酚胺類神經遞質如DA生物合成過程所需的限速酶，也是多巴胺能神經元的標志酶，催化酪氨酸的羥化而生成多巴，而COMT是促進DA代謝的主要相關酶之一。而紋狀體中美多巴組和聯合中和高劑量組TH和COMT水平相近，這一結果表明美多巴組和聯合中和高劑量組對DA代謝程度影響相近。以上結果提示，聯合用藥可能是通過增強DDC活性來提高紋狀體DA水平，其相關機制可能與美多巴治療帕金森病的機制不同。此外，美多巴組和聯合高劑量組紋狀體中DOPAC和HVA含量相似，即美多巴組與聯合高劑量組對多巴胺代謝影響區(qū)別不大。

在血漿中，美多巴組L-dopa最高，L-dopa的含量高于聯合各劑量組，而DA水平剛好與之相反。重要的是，聯合各劑量組DDC表達均高于其他治療組，呈一定的劑量依賴性。結果表明β-細辛醚可加速L-dopa脫羧過程。此外，聯合各劑量組和美多巴組COMT水平相近。聯合各劑量組DOPAC和HVA水平高于模型組。聯合高劑量組HVA與美多巴組相近。結果表明聯合用藥同時促進DA的代謝和提高COMT的活性。

除此之外，研究發(fā)現5-HT激活的障礙已經涉及帕金森病的精神障礙[18]。6-OHDA損傷的帕金森病大鼠可能誘發(fā)類似焦慮行為[19]。有研究發(fā)現帕金森病大鼠紋狀體DA和5-HT沒有明顯的相關性[20]。結果表明聯合各劑量組和美多巴組5-HT在血漿和紋狀體顯示無統計學意義。因此，聯合用藥治療帕金森病大鼠對紋狀體的5-HT影響不明顯。

綜上所述，β-細辛醚和L-dopa聯合用藥可提高紋狀體DA水平，可能是通過調節(jié)DA相關酶(DDC、COMT和TH)作用從而促進L-dopa轉化，大大提高L-dopa在大腦內的使用程度，避免其在外周的代謝，將大大減少L-dopa的使用劑量和副作用。因此，β-細辛醚和L-dopa聯合應用可能是一種潛在治療帕金森的有效方案。