吳 芳， 羅定強(qiáng)， 樊寶娟， 楊海燕， 戴 涌， 劉海靜

(陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710061)

地黃為玄參科植物地黃RehmanmiaglutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根，性寒，重于清熱涼血，養(yǎng)陰生津，經(jīng)炮制成熟地黃后由寒轉(zhuǎn)溫，功效由清轉(zhuǎn)補(bǔ)，重于補(bǔ)血滋陰、益精填髓[1]?，F(xiàn)代研究表明，熟地黃具有其他多種藥理作用[2-7]，生熟之品藥性迥異。

目前，熟地黃炮制的溫度、時(shí)間等工藝參數(shù)尚無(wú)嚴(yán)格的規(guī)定，實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中判定炮制是否完全及與生地黃進(jìn)行區(qū)分主要依靠顏色、質(zhì)地等感官指標(biāo)，但熟地黃的質(zhì)量控制必須依賴(lài)現(xiàn)代分析儀器及量化指標(biāo)。2020年版《中國(guó)藥典》收載的大約130個(gè)中藥制劑中含有熟地黃，但僅有少數(shù)在其檢驗(yàn)項(xiàng)目列入了顯微鑒別和薄層色譜鑒別。近年來(lái)，研究熟地黃化學(xué)成分[8-11]及其含量動(dòng)態(tài)變化[12-15]的報(bào)道較多，但尚未見(jiàn)制劑中熟地黃原料的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[11-12]模擬熟地黃的炮制過(guò)程，選擇甘露三糖、水蘇糖作為指標(biāo)成分，測(cè)定了部分飲片及杞菊地黃口服液中兩者含量，以期為該藥材質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters Alliance 2695高效液相色譜儀，配置Alltech ELSD 3300 ES 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，購(gòu)自美國(guó)Waters公司；BP211D、BS224S電子分析天平，購(gòu)自德國(guó)賽多利斯公司；KQ-500DE超聲波清洗儀，購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司；高速勻漿機(jī)，購(gòu)自德國(guó)IKA公司。

1.2 試劑 水蘇糖對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)112031-201701，純度90.5%)；甘露三糖對(duì)照品(上海同田生物技術(shù)有限公司，CAS號(hào)13382-86-0，E-2856，以98.0%計(jì))。生地黃、熟地黃對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為121180-201105、121196-201105)。水為高純水；乙腈為色譜純(美國(guó)Avantor Penformance Materials公司)。

1.3 藥物與藥材 65批杞菊地黃口服液來(lái)自市場(chǎng)；按照處方和工藝，使用合格飲片自制的陽(yáng)性樣品1批、不含熟地黃的陰性樣品1批；生地黃飲片(編號(hào)生地黃1～生地黃7)、熟地黃飲片(編號(hào)熟地黃1～熟地黃8)購(gòu)自連鎖藥店及市場(chǎng)。鮮地黃采自陜西西安長(zhǎng)安區(qū)，經(jīng)陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院羅定強(qiáng)主任藥師鑒定為玄參科植物地黃RehmanmiaglutinosaLibosch.的塊根，切片，緩緩烘焙至八成干，按炮制規(guī)范要求加熱蒸制，蒸制過(guò)程中每隔4 h取樣1次，共8次。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Carbohydrate色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，PN 840300-908)；流動(dòng)相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～5 min，90%A；5～65 min，90%～65%A)；體積流量0.8 mL/min；柱溫35 ℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；漂移管溫度95 ℃；氣體體積流量3.0 L/min。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取甘露三糖、水蘇糖對(duì)照品適量，加水制成質(zhì)量濃度分別為0.806 5、1.945 8 mg/mL的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取炮制品適量，粉碎成粗粉，精密稱(chēng)取2 g，置于錐形瓶中，精密加入50 mL水浸泡1 h，高速勻漿機(jī)處理1 min后超聲提取30 min，離心，取上清液，即得(必要時(shí)進(jìn)行稀釋)。另取口服液、自制陽(yáng)性樣品、不含熟地黃的陰性樣品適量，搖勻，各精密量取3 mL(含熟地黃約1.95 g)，加水至10 mL，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 吸取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液各5 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，陰性樣品色譜圖中在甘露三糖、水蘇糖對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致的位置上未發(fā)現(xiàn)色譜峰，表明該方法專(zhuān)屬性良好。

1.甘露三糖 2.水蘇糖

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別稱(chēng)取甘露三糖、水蘇糖對(duì)照品41.15、107.50 mg，置于10 mL量瓶中，加水制成質(zhì)量濃度分別為4.032 7、9.728 8 mg/mL的對(duì)照品溶液，稀釋成系列質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣5 μL測(cè)定。以峰面積對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得到甘露三糖、水蘇糖方程分別為Y=1.20X+5.98(r=0.999 8)、Y=1.08X+6.11(r=0.999 9)，分別在0.161 3～4.032 7、0.389 2～9.728 8 mg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。另外，兩者檢測(cè)限分別為0.18、0.22 mg/mL。

2.5 精密度試驗(yàn) 取甘露三糖、水蘇糖質(zhì)量濃度分別為0.806 5、1.945 8 mg/mL的對(duì)照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得兩者峰面積RSD分別為2.6%、2.7%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取熟地黃(編號(hào)5)適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得甘露三糖、水蘇糖含量RSD分別為3.0%、3.5%；取口服液(批號(hào)170701)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得兩者含量RSD分別為0.20%、2.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

2.7.1 熟地黃 取熟地黃(編號(hào)5)適量，粉碎成粗粉，精密稱(chēng)取6份，每份1 g，精密加入對(duì)照品溶液(甘露三糖、水蘇糖質(zhì)量濃度分別為197.098、13.325 mg/mL)各1 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 熟地黃中各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.7.2 杞菊地黃口服液 精密量取口服液(批號(hào)170701)1.5 mL，精密加入對(duì)照品溶液(甘露三糖、水蘇糖質(zhì)量濃度分別為2.927、1.042 mg/mL)各1 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 杞菊地黃口服液中各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.8 樣品含量測(cè)定 地黃飲片中甘露三糖、水蘇糖含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，可知65批口服液中兩者質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別為0～4.04、0～10.2 mg/mL。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

熟地黃炮制時(shí)要求反復(fù)蒸曬[8]，直至“色黑如漆，味甘如飴”[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，炮制可使水蘇糖含量逐漸降低，甘露三糖含量逐漸升高，同時(shí)顏色由黃棕色逐漸加深變黑，味道甜度增加，當(dāng)蒸制約20 h時(shí)，熟地黃表面及斷面呈烏黑色，柔軟有光澤，黏性大，按法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)符合規(guī)定，此時(shí)水蘇糖、甘露三糖含量比值約為0.1。7批生地黃中水蘇糖、甘露三糖含量比值約為4.6～11.4，僅有1批小于5.0，其斷面顏色為黑棕色，其余均大于7；8批熟地黃中兩者比值為0.06～0.29，僅有1批大于0.20，其較大塊的斷面可見(jiàn)少量黃心，可能炮制不完全。

熟地黃飲片質(zhì)韌軟黏，不易粉碎成細(xì)粉。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了粉碎成粗粉再高速勻漿處理、直接粉碎以及冷凍后粉碎3種處理方法，結(jié)果第1種方法簡(jiǎn)便，易操作，各成分含量較高，重復(fù)性好，故選擇其作為供試液的制備方法。

甘露三糖為熟地黃中特有的活性成分，在炮制過(guò)程中由水蘇糖轉(zhuǎn)化而來(lái)[16]，含量較高，藥效確切。本實(shí)驗(yàn)證明了依據(jù)甘露三糖、水蘇糖的含量及其比值為指標(biāo)來(lái)判斷炮制程度和區(qū)分生熟地黃，其結(jié)論與采用感觀判斷方法得到的結(jié)論相一致。

65批杞菊地黃口服液中，有12批未檢出甘露三糖和水蘇糖，提示該12批樣品可能使用提取過(guò)有效成分的熟地黃藥渣或者再生的熟地黃[17]進(jìn)行投料；另外有16批樣品中水蘇糖的含量大于甘露三糖(兩者比值為2.0～3.3)，提示熟地黃原料可能炮制不完全。研究結(jié)果表明，該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)需要進(jìn)行提升。