周敬凱， 翁競玉， 朱 盼， 李 麗

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001)

地菍別名地稔、鋪地稔等，為野牡丹科植物地菍MelastomadodecandrumLour.的全草，分布于長江以南的廣西等省區(qū)，資源豐富，是廣西民間常用草藥，其味甘、微澀，性微涼，具有清熱解毒、活血止血等功效。課題組前期發(fā)現(xiàn)[1-6]，地菍提取液能調(diào)節(jié)實驗性高脂血癥小鼠的血脂紊亂現(xiàn)象，而對正常小鼠空腹血糖無影響，并且對糖尿病大、小鼠模型均有體質(zhì)量減輕的作用，具有潛在的抑制肥胖作用，但目前還未見關(guān)于地菍總黃酮對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠的干預(yù)作用及機制報道。因此，本實驗參考《保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法》，在給予高熱量、高脂食物誘發(fā)大鼠肥胖的同時以地菍總黃酮干預(yù)，考察體質(zhì)量、血脂等生理生化指標(biāo)改變，同時考察該成分對肥胖大鼠腸道菌群的影響，為將其開發(fā)成減肥降脂產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，85只，體質(zhì)量180～200 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(湘)2016-0002。

1.2 藥材及飼料 地菍購自南寧小瑤王藥店，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物教研室的梁子寧教授鑒定為地菍MelastomadodecandrumLour.的干燥全草。按照黃馨慧等[7]報道的方法，藥材粉碎后用50%乙醇提取，濾液減壓濃縮后經(jīng)AB-8大孔樹脂純化，蒸干后得到粉末備用，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法測定其質(zhì)量分數(shù)為71.3%。普通飼料由上海斯萊克實驗動物有限公司提供；高脂飼料參考《保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法》，由實驗室自行制作，配方為蔗糖15%、豬油15%、蛋白粉10%、膽固醇1%、膽酸鈉0.2%、基礎(chǔ)飼料58.8%。

1.3 試劑及儀器 奧利司他片購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司。總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low desity lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high desity lipoprotein cholesterol，HDL-C)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。RE-501型升降恒溫水浴鍋(上海予華儀器設(shè)備有限公司)；CCA-20型低溫冷卻水循環(huán)泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；Infinite M200PRO型全波長酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；UV-1901雙束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；5415D型冷凍低溫離心機(德國Eppendorf公司)；HWS-26電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；XP cycler型PCR儀(杭州博日科技有限公司)；Hiseq型高通量測序儀(美國Illumina公司)。

1.4 分組與給藥 以85只SPF級SD大鼠為實驗對象，隨機分成空白組(10只)及誘導(dǎo)組(75只)，空白組大鼠給予普通飼料，誘導(dǎo)組大鼠給予高脂飼料。喂養(yǎng)2周后淘汰25只肥胖抵抗大鼠，其余隨機分為模型組(高脂飼料)、奧利司他組(高脂飼料+60 mg/kg奧利司他)、地菍總黃酮高劑量組(高脂飼料+750 mg/kg地菍總黃酮)、地菍總黃酮中劑量組(高脂飼料+500 mg/kg地菍總黃酮)、地菍總黃酮低劑量組(高脂飼料+330 mg/kg地菍總黃酮)，連續(xù)給藥6周，空白組及模型組給予相同容量的蒸餾水。

1.5 樣本采集 給藥6周后，隨機采集空白組、模型組及地菍總黃酮高劑量組大鼠糞便(n=6)，置于-80 ℃冰箱中保存，用于腸道菌群的檢測；麻醉后稱量各組大鼠體質(zhì)量，測量體長后腹主動脈取血，血樣樣本離心收集血清，置于-80 ℃冰箱中冷凍保存，用于生化指標(biāo)的檢測；收集大鼠雙腎周圍及附睪周圍白色脂肪，用于脂肪系數(shù)的測定。

1.6 指標(biāo)測定

1.6.2 脂肪系數(shù) 分離大鼠雙腎及附睪周圍的白色脂肪組織，稱定質(zhì)量后計算脂肪系數(shù)，公式為脂肪系數(shù)=(m1/m)×100%(m1為大鼠雙腎及附睪周圍白色脂肪組織質(zhì)量，m為大鼠體質(zhì)量)。

1.6.3 血清生化指標(biāo) 包括TG、TC、LDL-C、HDL-C水平，按照各試劑盒說明書操作進行測定。

1.6.4 糞便DNA提取和測序 采用 SDS 裂解液凍融法對空白組、模型組、地菍總黃酮高劑量組進行 DNA 提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和濃度，采用正向引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和反向引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增。Barcode 采用特定的 7-bp 特定序列合成到序列中，將PCR體系進行擴增、純化、量化后，采用Hiseq高通量測序儀測序。

1.6.5 生物信息學(xué)分析 根據(jù)Barcode序列和引物序列從原始數(shù)據(jù)中拆分各個樣本的數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后使用Vsearch v2.4.4軟件對每個樣品的reads進行拼接，同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾，除去序列小于150 bp、平均質(zhì)量值低于20、含有不明確堿基的序列、含有>8 bp的單核苷酸重復(fù)序列，得到最終有效序列(effective tags)。OTU分析使用 Vsearch v2.4.4軟件分析，以97%相似度將序列聚類成操作分類單元(operational taxonomic units，OUT)，通過VSEARCH 基于 SILVA128數(shù)據(jù)庫對代表序列進行物種注釋，進行OUT水平Alpha多樣性指數(shù)計算及不同組間菌群組成的相似性。

2 結(jié)果

2.1 地菍總黃酮對高脂飲食大鼠體質(zhì)量增重、Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù)的影響 由表1可知，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)及雙腎、附睪周圍脂肪系數(shù)升高(P<0.01)，說明模型建立成功；與模型組比較，奧利司他組和地菍總黃酮高、中、低劑量組大鼠體質(zhì)量及雙腎、附睪脂肪系數(shù)均降低(P<0.01)；奧利司他組、地菍總黃酮高劑量組大鼠Lee’s指數(shù)降低(P<0.01)。

表1 地菍總黃酮對高脂飲食大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù)的影響

2.2 地菍總黃酮對大鼠血脂的影響 由表2可知，與空白組比較，模型組大鼠TC、TG水平升高(P<0.01)，HDL-C水平降低(P<0.01)，說明長期的高脂飲食誘導(dǎo)造成了大鼠血脂紊亂；與模型組比較，奧利司他組大鼠TC水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.05)；地菍總黃酮高劑量組大鼠TC、TG水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.01)；地菍總黃酮中劑量組大鼠TG水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.05)。

表2 地菍總黃酮對高脂飲食大鼠血脂的影響

2.3 地菍總黃酮對大鼠腸道菌群的影響

2.3.1 平均有效序列、平均操作單元、平均覆蓋度 由表3可知，空白組糞便菌群平均有效序列為132 370條，經(jīng)97%相似性歸并后得到平均操作單元(OTUs)821個，平均測序覆蓋深度(coverage指數(shù))0.998 9；模型組獲得平均有效序列131 568條，經(jīng)97%相似性歸并后得到平均OTUs為576個，平均測序覆蓋指數(shù)為0.999；地菍總黃酮高劑量組糞便菌群獲得平均有效序列127 318條，經(jīng)97%相似性歸并后得到平均OTUs數(shù)707個，平均測序覆蓋深度為0.998 9。各組平均有效序列均高達12萬條以上，說明樣本滿足測序要求；各組平均測序深度均在0.998以上，說明樣品中序列未被測到的概率較低；空白組、模型組及地菍總黃酮高劑量組之間OTUs雖無差異，但與模型組比較，地菍總黃酮干預(yù)后有所增加，說明地菍總黃酮有提高高脂飲食大鼠菌群物種多樣性的趨勢。

表3 地菍總黃酮對大鼠腸道菌群平均有效序列、平均操作單元、平均覆蓋度的影響

2.3.2 OTU組成相似性 圖1顯示，空白組、模型組、地菍總黃酮高劑量組OTUs數(shù)目分別為1 928、1 527、1 599，其中996個OTUs為3組所共有；3組均檢出其特異的OTUs，分別為432、179、99；空白組與模型組共有的OTU數(shù)目為174，空白組與地菍總黃酮高劑量組共有的OTUs數(shù)目為326，表明地菍總黃酮提高了高脂飲食大鼠腸道菌群的多樣性，同時也增加了高脂飲食大鼠與空白組 OTU 組成的相似性。

注：A為空白組，B為地菍總黃酮高劑量組，C為模型組。

2.3.3 Alpha多樣性 由表4可知，空白組、模型組、地菍總黃酮高劑量組Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均無明顯差異(P>0.05)；與模型組比較，地菍總黃酮高劑量組的Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)及Shannon指數(shù)均有升高趨勢，而且逐漸向空白組接近，提示地菍總黃酮有提高高脂飲食大鼠腸道菌群Alpha多樣性的趨勢。

表4 地菍總黃酮對大鼠腸道菌群Alpha多樣性分析

2.3.4 地菍總黃酮對大鼠腸道菌群門水平的影響 由表5可知，與空白組比較，模型組厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度升高(P<0.05)，擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度降低(P<0.01)；與模型組比較，地菍總黃酮高劑量組擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度升高(P<0.01)，厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度降低(P<0.01)。

表5 各組大鼠糞便在門水平上的相對豐度

2.3.5 地菍總黃酮對大鼠腸道菌群屬水平的影響 由表6可知，與空白組比較，模型組摩根氏菌屬(Morganella)、支原體菌屬(Allobaculum)、柯林斯氏菌屬相對豐度升高(P<0.05，P<0.01)，考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、普雷沃茨菌屬(Prevotella)、CF231菌屬相對豐度降低(P<0.05)；與模型組比較，地菍總黃酮高劑量組變形桿菌屬(Proteus)、羅斯氏菌屬(Roseburia)、CF231菌屬、普雷沃茨菌屬(Prevotella)相對豐度升高(P<0.05，P<0.01)，摩根氏菌屬(Morganella)相對豐度降低(P<0.01)。

表6 各組大鼠糞便在屬水平上的相對豐度

3 討論

長期高脂飲食是引起肥胖、糖尿病、高血壓、動脈硬化等疾病的重要危險因素之一[8-9]。體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù)是反映動物肥胖程度的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)地菍總黃酮能有效抑制高脂飲食誘導(dǎo)SD大鼠的體質(zhì)量增加，降低Lee’s指數(shù)和脂肪系數(shù)，證實地菍總黃酮能有效抑制高脂飲食的轉(zhuǎn)化與吸收，從而控制體質(zhì)量增長。血脂紊亂是肥胖患者常見的代謝標(biāo)志之一，血脂水平能夠反映全身性的脂質(zhì)代謝狀態(tài)[10-11]。由于現(xiàn)代人們對高脂飲食的習(xí)慣，飲食中攝入大量膽固醇及脂肪，體內(nèi)的游離脂肪酸增多，積聚的甘油三酯也逐漸增多，進而導(dǎo)致血脂異常。本實驗發(fā)現(xiàn)地菍總黃酮能有效降低大鼠血清中TG和TC水平，提高HDL-C水平，LDL-C也有一定程度的改善作用，提示地菍總黃酮對高脂飲食大鼠具有降血脂的作用。

腸道菌群多樣性是促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收、維持機體免疫和新陳代謝的基礎(chǔ)，高脂飲食會導(dǎo)致腸道菌群多樣性減少，膜完整性改變，導(dǎo)致通透性增加和脂多糖移位增加，免疫系統(tǒng)發(fā)生變化，產(chǎn)生炎癥[12]。長期高脂飲食會降低腸道菌群的多樣性，本實驗初步探究地菍總黃酮對腸道菌群Alpha多樣性及結(jié)構(gòu)的影響，與空白組比較，模型組OTU數(shù)降低、腸道菌群Alpha多樣性降低；與模型組比較，地菍總黃酮高劑量組OTU數(shù)升高、腸道菌群多樣性升高。有研究表明，厚壁菌門和擬桿菌門的水平和比例與宿主的身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)有關(guān)[13]。Ley等[14]發(fā)現(xiàn)，肥胖人群厚壁菌門/擬桿菌門比值高于體質(zhì)量正常人群，這與本研究結(jié)果相符，經(jīng)過給予地菍總黃酮進行干預(yù)，高脂飲食大鼠擬桿菌門豐度升高，厚壁菌門豐度降低，厚壁菌門/擬桿菌門比值降低，且體質(zhì)量降低。摩根氏菌屬(Morganella)是一種條件致病菌，體內(nèi)過多會使菌群比例失衡，發(fā)生泌尿感染等疾病[15]。普雷沃茨菌屬(Prevotella)能降解食物中的碳水化合物和多糖，并能參與合成多種維生素，有學(xué)者認為該菌種能產(chǎn)生對維持人體健康具有多種重要作用的短鏈脂肪酸(SCFA)，抑制條件致病菌，保護宿主免受炎癥和非感染性結(jié)腸疾病的侵害[16]。也有研究發(fā)現(xiàn)[17]，高脂肪飲食所導(dǎo)致的超重或肥胖兒童體內(nèi)普雷沃茨菌屬的豐度降低?？祭瓧U菌屬(Phascolarctobacterium)能產(chǎn)生短鏈脂肪酸，對維持人體健康具有多種重要作用，如增強胃腸道機能、降低炎癥水平等，據(jù)報道其相對水平與人類的積極樂觀的情緒有關(guān)[18]。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過給予地菍總黃酮，增加了高脂飲食大鼠的腸道多樣性，上調(diào)了擬桿菌門、考拉桿菌屬及普雷沃茨菌屬等潛在有益菌的相對豐度，下調(diào)厚壁菌門及摩根氏菌屬等條件致病菌的相對豐度，這可能與地菍總黃酮影響腸道菌群，提高腸道菌群多樣性，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，抑制腸道內(nèi)毒素進入血液誘發(fā)炎癥反應(yīng)，進而發(fā)揮降脂減重的作用機制有關(guān)。但由于體內(nèi)腸道菌群是一個大整體，細菌菌群相互促進、相互制約的關(guān)系，具體機制有待進一步探究。

綜上所述，本實驗結(jié)果顯示地菍總黃酮能降低高脂飲食大鼠體質(zhì)量及增重，其作用機制可能與調(diào)節(jié)血脂紊亂有關(guān)；同時本研究采用高通量測序技術(shù)，初步探究了地菍總黃酮對高脂飲食大鼠腸道菌群的影響，推測其作用機制可能同降低厚壁菌門/擬桿菌門比值、降低條件致病菌、提高腸道菌群多樣性、改善菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)。