錢 浩, 林 芝#, 周佳瑛, 賴嘉新, 吳志炫, 黃 溶, 黃蕾蕾, 董晨琳,陳子怡, 王 特*
(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,溫州醫(yī)科大學(xué)育英兒童醫(yī)院,浙江 溫州 325027;2.溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,溫州醫(yī)科大學(xué)信息與工程學(xué)院,浙江 溫州 325035;3.溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟(jì)學(xué)院,浙江 溫州 325035)
脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)預(yù)后不良并伴有一系列并發(fā)癥[1]。與周圍神經(jīng)系統(tǒng)或胚胎期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同,成年哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)生損傷后,軸突再生極為有限[2-3]。軸突再生障礙主要由神經(jīng)元發(fā)育成熟過(guò)程中本身生長(zhǎng)動(dòng)力的減弱以及損傷后抑制性細(xì)胞微環(huán)境的形成所導(dǎo)致,這也是脊髓損傷預(yù)后不良的關(guān)鍵與治療的難點(diǎn)[4]。近年來(lái),細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)作為軸突再生的關(guān)鍵因素受到廣泛關(guān)注。微管作為細(xì)胞骨架的關(guān)鍵組分,在正常神經(jīng)元中,其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,平行排列并聚集成束,并延伸至軸突末端參與組成生長(zhǎng)錐,進(jìn)而參與軸突生長(zhǎng)[5];而脊髓損傷后,微管的穩(wěn)定性被打破,軸突再生被顯著抑制[6]。多項(xiàng)研究表明,通過(guò)藥理作用增加微管穩(wěn)定性能夠激活軸突再生潛能從而改善脊髓損傷后的運(yùn)功功能,促進(jìn)恢復(fù),因此調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性可作為脊髓損傷治療的重要研究方向[7-8]。葒草苷(Orientin,ORT)是一種C-糖基類黃酮,主要提取自剛竹屬竹葉、圣羅勒、西番蓮、烏蕨和金蓮花等藥用植物中。根據(jù)已有研究報(bào)道,葒草苷具有神經(jīng)保護(hù)、抗心肌缺血、抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[9-12]。但葒草苷在脊髓損傷模型中尚未報(bào)道,其治療功能不明,作用機(jī)制不清。本研究發(fā)現(xiàn):葒草苷給藥可以穩(wěn)定微管以激活軸突再生潛能,從而促進(jìn)脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù),表明葒草苷具有作為治療脊髓損傷候選藥物的潛力。
1.1 動(dòng)物 成年雌性SD大鼠8周齡,體質(zhì)量220~230 g,共36只,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2017-0005。
1.2 藥物與試劑 葒草苷(純度≥98%,CAS號(hào)28608-75-5,批號(hào)MUST-19071508)對(duì)照品購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。CCK-8試劑盒(貨號(hào)CA1210)、胰蛋白酶-EDTA消化液(貨號(hào)T1320)、DAPI復(fù)染試劑(貨號(hào)D8200)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;Hank’s緩沖液(貨號(hào)13150016)、DMEM/F-12培養(yǎng)基(貨號(hào)11320033)、神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基(貨號(hào)21103049)、TRIzol試劑(貨號(hào)15596018)、2% B27(貨號(hào)17504044)、0.5 mmol/LL-谷氨酰胺(貨號(hào)21051024)、胎牛血清(貨號(hào)10100147)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;兔抗GAP43抗體(貨號(hào)ab16053)、兔抗Tuj-1抗體(貨號(hào)ab18207)、兔抗GAPDH抗體(貨號(hào)ab9485)、兔抗Ace-tubulin抗體(貨號(hào)ab179484)、兔抗GFAP抗體(貨號(hào)ab7260)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;兔抗Tyr-tubulin抗體(貨號(hào)MAB1864-I)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;BCA試劑盒(貨號(hào)P0012)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。
1.3 儀器 Thermo 8000系列水套式3429 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、ABI QuantStudio5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientifie公司);Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司);Western blot電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司);ECLIPSE 80i 共聚焦熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。
2.1 原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)及氧糖剝奪模型建立 原代神經(jīng)元提取自新生SD乳鼠,皮質(zhì)與大腦剝離、清理血管后,將皮質(zhì)組織剪切成小塊,置于預(yù)冷的Hank’s緩沖液中,在37 ℃下用0.125%胰蛋白酶-EDTA處理25 min,溶液用100 μm細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾,1 000 r/min離心5 min。細(xì)胞沉淀重懸于完全DMEM/F-12培養(yǎng)基中,并放置在37 ℃下含5% CO2、空氣濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中孵育,4 h后將培養(yǎng)基更換為含有2% B27、0.5 mmol/LL-谷氨酰胺的神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基,繼續(xù)在上述條件中培養(yǎng),每隔3 d更換1次培養(yǎng)基。氧糖剝奪(OGD)處理細(xì)胞,模擬體外脊髓損傷,吸取神經(jīng)元細(xì)胞原有的培養(yǎng)基,PBS洗3次,加入無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基,置于三氣孵育培養(yǎng)箱[O2/CO2/N2(1%/5%/94%)]中處理,使細(xì)胞處于氧糖剝奪狀態(tài),將神經(jīng)元細(xì)胞置于氧糖剝奪(OGD)環(huán)境中作用6 h,同時(shí)不給予或給予不同濃度葒草苷處理48 h。根據(jù)以上處理因素將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、OGD組、OGD+葒草苷組,進(jìn)行CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)、RT-qPCR、免疫熒光染色、Western Blot分析。
2.2 葒草苷細(xì)胞毒性檢測(cè) 將100 μL神經(jīng)元懸液置于96孔板中,孵育24 h后,向各孔中加入不同濃度(0、2.5、5、10、25、50 μmol/L)葒草苷再孵育48 h,滴加10 μL CCK8溶液,將細(xì)胞與含90 μL培養(yǎng)基、10 μL CCK-8、100 μL CCK-8的混合物在37 ℃下培養(yǎng)2 h,在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,確定細(xì)胞活力。
2.3 RT-qPCR檢測(cè) 用OGD處理神經(jīng)元細(xì)胞后,加入不同濃度(0、2.5、5、10、25、50 μmol/L)葒草苷,3 d后使用TRIzol試劑從神經(jīng)元細(xì)胞中提取總RNA以合成cDNA。對(duì)樣品中Nefh、Gap43 mRNA表達(dá)進(jìn)行分析,引物見(jiàn)表1。
表1 RT-qPCR引物序列
2.4 Western Blot檢測(cè) 分別向空白對(duì)照組、OGD組、OGD+葒草苷組神經(jīng)元細(xì)胞中加入RIPA裂解緩沖液提取總蛋白,BCA試劑盒定量總蛋白,SDS-PAGE法分離出蛋白樣品(40 μg)并轉(zhuǎn)到PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉1.5 h,將膜與一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜,加入anti-GAP43(1∶1 000)、anti-Ace-tubulin(1∶1 000)、anti-Tyr-tubulin(1∶500)、anti-GAPDH(1∶10 000),在室溫下與相應(yīng)二抗孵育1 h。條帶可視化由ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)完成,并通過(guò)Image Lab3.0軟件分析定量。
2.5 脊髓損傷大鼠模型建立及葒草苷給藥 將36只成年雌性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、脊髓損傷組、脊髓損傷+葒草苷給藥組,適應(yīng)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行造模。腹腔注射8%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉后備皮消毒,沿脊中線切開(kāi),通過(guò)椎板切除術(shù)暴露脊髓于T9椎體水平,暴露的脊髓用動(dòng)脈夾(30 g)夾閉脊髓1 min;假手術(shù)組僅暴露脊髓而不夾閉。術(shù)后護(hù)理包括每天2次輔助排尿至膀胱功能恢復(fù),并使用頭孢唑林鈉(50 μg/kg,腹腔注射)預(yù)防感染,同時(shí)在每天固定時(shí)段通過(guò)腹腔注射對(duì)脊髓損傷+葒草苷給藥組大鼠給予葒草苷(25 mg/kg),持續(xù)28 d。所有外科手術(shù)和術(shù)后動(dòng)物護(hù)理均經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),操作均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南》。
2.6 免疫熒光染色 4%多聚甲醛分別固定空白對(duì)照組、OGD組、OGD+葒草苷組神經(jīng)元細(xì)胞20 min后,PBS清洗3次,每次5 min。從飼養(yǎng)28 d的脊髓損傷組以及脊髓損傷+葒草苷給藥組的大鼠中分離得到脊髓組織(損傷中心兩側(cè)各保留1 cm),在4%多聚甲醛中固定24 h,乙醇脫水后石蠟包埋切片(厚度5 μm),在37 ℃下用5% BSA封閉液封閉細(xì)胞及切片30 min,在4 ℃下與一抗孵育過(guò)夜,加入anti-Tuj-1(1∶1 000)、anti-Ace-tubulin(1∶1 000)、anti-Tyr-tubulin(1∶500)、anti-GFAP(1∶500),孵育后以PBST漂洗3次, 在37 ℃下與相應(yīng)二抗孵育60 min,繼續(xù)用PBST洗滌,與DAPI溫育后封片。所有圖像均用共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行捕獲,通過(guò)Image J圖像分析軟件對(duì)神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度進(jìn)行定量分析,測(cè)量每個(gè)神經(jīng)元最長(zhǎng)的神經(jīng)突,每個(gè)圖像平均選擇10個(gè)代表性神經(jīng)元,每個(gè)條件選擇4個(gè)代表性圖像。
2.7 行為學(xué)評(píng)價(jià) 為了評(píng)價(jià)脊髓損傷后的恢復(fù)特征,由2名對(duì)實(shí)驗(yàn)條件不知情、訓(xùn)練有素的研究人員進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)。Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)量表評(píng)分和斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分選擇在造模后的第0、1、7、14、28天進(jìn)行,其中前者是將大鼠置于空曠場(chǎng)地,2名觀察者根據(jù)其肢體和關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)、肢體協(xié)調(diào)性、穩(wěn)定性、尾巴位置、腹部位置的組合給出0~21分的評(píng)分;后者是將大鼠放在1塊覆蓋有橡膠墊的光滑木板上,斜板可繞其底部旋轉(zhuǎn),體軸平行于板的垂直軸,之后逐漸增大斜板與水平面間夾角,當(dāng)大鼠恰好在斜板上停留5 s時(shí)記錄角度。每只大鼠重復(fù)5次。
3.1 葒草苷對(duì)原代神經(jīng)元的細(xì)胞毒性作用 葒草苷分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1A,本實(shí)驗(yàn)在原代神經(jīng)元中加入不同濃度(0、2.5、5、10、25、50 μmol/L)該成分并孵育48 h,結(jié)果見(jiàn)圖1B。由此可知,各組吸光度均無(wú)顯著差異(P>0.05),提示葒草苷在0~50 μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)原代神經(jīng)元無(wú)細(xì)胞毒性作用。
圖1 葒草苷對(duì)原代神經(jīng)元的細(xì)胞毒性
3.2 葒草苷促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生 本實(shí)驗(yàn)將不同濃度(0、2.5、5、10、25、50 μmol/L)葒草苷與OGD處理神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),并以神經(jīng)元軸突再生過(guò)程的關(guān)鍵蛋白——重肽神經(jīng)絲蛋白(NEFH)、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(GAP43)作為檢測(cè)指標(biāo),結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知,在3 d時(shí)葒草苷以劑量依賴性的方式使Nefh、Gap43 mRNA表達(dá)增加(P<0.05,P<0.01),在25、50 μmol/L劑量下相較于對(duì)照組(0 μmol/L)差異明顯(P<0.01),由于在50 μmol/L劑量下Nefh、Gap43 mRNA表達(dá)增加最高,故選擇其進(jìn)行后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)(圖2A~2B);與OGD組比較,OGD+葒草苷組神經(jīng)元細(xì)胞GAP43蛋白表達(dá)增加(P<0.05)(圖2C~2D);Tuj-1免疫熒光染色顯示,OGD+葒草苷組神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度為(103.2±13.45) μm,而OGD組僅為(49.00±10.03) μm(圖2E~2F),提示葒草苷能以劑量依賴性的方式促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生。
注:與OGD組比較,*P<0.05,**P<0.01。
3.3 葒草苷調(diào)節(jié)原代神經(jīng)元細(xì)胞微管穩(wěn)定 本實(shí)驗(yàn)以乙酰化微管蛋白(Ace-tubulin)、酪氨酸化微管蛋白(Tyr-tubulin)為指標(biāo),通過(guò)Western blot檢測(cè)其表達(dá),結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知,相較于OGD組,OGD+葒草苷組上調(diào)了乙?;⒐艿鞍妆磉_(dá)(P<0.05),降低了酪氨酸化微管蛋白表達(dá)(P<0.05)(圖3A~3C);免疫熒光染色(圖3D~3F)顯示,葒草苷增強(qiáng)了乙?;⒐艿鞍谉晒鈴?qiáng)度,降低了酪氨酸化微管蛋白熒光強(qiáng)度,使A/T比增加(P<0.01),表明葒草苷可調(diào)節(jié)原代神經(jīng)元細(xì)胞微管穩(wěn)定性。
注:與OGD組比較,*P<0.05,**P<0.01。
3.4 葒草苷調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定,促進(jìn)軸突再生 本實(shí)驗(yàn)對(duì)脊髓組織切片進(jìn)行免疫熒光染色,以GFAP標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞,Ace-tubulin標(biāo)記軸突,結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知,脊髓損傷后GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞在病灶邊緣積聚,而葒草苷增加了Ace-tubulin(+)面積,促進(jìn)了軸突生長(zhǎng)穿過(guò)病灶邊界并延伸至遠(yuǎn)端區(qū)域,與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
注:與脊髓損傷組比較,**P<0.01。
3.5 葒草苷促進(jìn)脊髓損傷大鼠功能恢復(fù) 本實(shí)驗(yàn)建立脊髓損傷大鼠模型后連續(xù)給藥28 d,分別于造模后0、3、7、14、28 d進(jìn)行BBB量表評(píng)分及斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分,結(jié)果見(jiàn)圖5。由此可知,造模后第0天除假手術(shù)組外,其他2組大鼠BBB量表評(píng)分為0,表示造模成功;第14天脊髓損傷+葒草苷給藥組的BBB量表評(píng)分為8.000分,脊髓損傷組評(píng)分為5.333分;第28天時(shí)2組評(píng)分分別為10.17、7.000分;第14、28天時(shí)脊髓損傷+葒草苷給藥組斜板實(shí)驗(yàn)評(píng)分分別為34.17°、43.33°,高于脊髓損傷組的25.00°、30.83°(P<0.05,P<0.01),提示葒草苷可促進(jìn)脊髓損傷后功能恢復(fù)。
注:與脊髓損傷組比較,*P<0.05,**P<0.01。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的神經(jīng)再生是脊椎動(dòng)物自我修復(fù)能力的最大限制之一,也是當(dāng)代生物醫(yī)學(xué)研究中最令人困擾且無(wú)法治療的挑戰(zhàn)之一。目前臨床上尚無(wú)副作用小、療效好的治療藥物,而脊髓損傷所帶來(lái)的社會(huì)負(fù)擔(dān)不容忽視,因此,能夠有效促進(jìn)損傷脊髓結(jié)構(gòu)以及功能恢復(fù)的藥物是迫切需要的。
葒草苷作為一種提取自天然中草藥的黃酮類單體化合物,具有副反應(yīng)小、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道葒草苷在腦缺血/再灌注損傷中具有神經(jīng)保護(hù)作用[9]。同時(shí),葒草苷能抑制過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡[13]。Guo等[14]亦報(bào)道過(guò),葒草苷作為一種神經(jīng)保護(hù)劑,在脊神經(jīng)結(jié)扎模型中可用于神經(jīng)性疼痛的治療。研究證明,多種黃酮類化合物能夠調(diào)節(jié)軸突再生:如English等[15]發(fā)現(xiàn)7,8-二羥基黃酮作為原肌球蛋白受體激酶B的小分子激動(dòng)劑,能促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后的軸突再生;Wang等[16]證明了槲皮素可以促進(jìn)急性脊髓損傷后的軸突再生?;谏鲜?,本實(shí)驗(yàn)猜測(cè)葒草苷可能作用于脊髓損傷。
盡管改善脊髓損傷恢復(fù)涉及各種各樣的因素,但促進(jìn)軸突再生被認(rèn)為最有潛力,也是最有可能逆轉(zhuǎn)癱瘓的因素[17]。有研究表明通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)在信號(hào)、調(diào)節(jié)神經(jīng)元外部微環(huán)境、生物支架植入等方法促進(jìn)軸突生長(zhǎng)以改善脊髓損傷后功能的恢復(fù)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)葒草苷可以顯著增加Nefh、GAP43等軸突再生過(guò)程中關(guān)鍵蛋白的mRNA和(或)蛋白表達(dá),同時(shí)通過(guò)Tuj-1免疫熒光染色直觀地反映了葒草苷處理可以增加氧糖剝奪神經(jīng)元的軸突長(zhǎng)度,提示其能夠促進(jìn)軸突再生。
微管是細(xì)胞骨架的關(guān)鍵組分,在正常神經(jīng)元中,其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,平行排列并聚集成束,并延伸至軸突末端參與組成生長(zhǎng)錐,進(jìn)而參與軸突生長(zhǎng)[5]。多項(xiàng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元在損傷后無(wú)法重建功能性生長(zhǎng)錐[19-21];然而外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元可以再生出功能性的活動(dòng)末梢[22]。兩者的主要差異在于損傷部位的細(xì)胞骨架的微管結(jié)構(gòu):小鼠坐骨神經(jīng)損傷后,生長(zhǎng)錐的大小仍恒定,微管保持了典型的束狀結(jié)構(gòu);而脊髓損傷后,微管的穩(wěn)定性被打破,其排列變得雜亂無(wú)章且在細(xì)胞內(nèi)分布不均,生長(zhǎng)錐轉(zhuǎn)化為腫脹的、無(wú)生長(zhǎng)能力的回縮泡結(jié)構(gòu)[23]。微管穩(wěn)定除了上文所述的具有調(diào)節(jié)軸突尖端由回縮泡結(jié)構(gòu)向生長(zhǎng)錐轉(zhuǎn)變的作用外,其對(duì)于調(diào)節(jié)損傷軸突再生的啟動(dòng)至少還包括以下兩方面:一是神經(jīng)元的極化受微管穩(wěn)定性狀態(tài)的調(diào)控[24];二是微管穩(wěn)定在軸突再生所需細(xì)胞器(例如線粒體)、蛋白質(zhì)(例如肌動(dòng)蛋白)等的定向運(yùn)輸過(guò)程中起重要作用[25]。Ertürk等[22]報(bào)道使用微管解聚藥物諾考達(dá)唑處理背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元后,可將微管分散,軸突尖端轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃朴谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)損傷后的回縮泡結(jié)構(gòu)。相反,通過(guò)埃坡霉素B、紫杉醇等藥理性微管穩(wěn)定作用,可增強(qiáng)軸突尖端處的微管聚合,以促進(jìn)神經(jīng)元的極化與再生[7, 26]。因此,恢復(fù)微管的穩(wěn)定性是促進(jìn)脊髓損傷后軸突再生與功能恢復(fù)的重要途徑。在原代神經(jīng)元細(xì)胞中,本研究通過(guò)Western blot及免疫熒光等實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)葒草苷可以上調(diào)乙酰化微管蛋白的表達(dá),同時(shí)降低酪氨酸化微管蛋白的表達(dá),增加A/T比值,提高微管的穩(wěn)定性,從而促進(jìn)軸突再生。脊髓組織切片的免疫熒光實(shí)驗(yàn)亦支持了上述結(jié)果。同時(shí),與埃坡霉素B、紫杉醇等抗腫瘤藥物比較,葒草苷作為天然中草藥提取物,其副反應(yīng)小且價(jià)格較低,具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
最后利用急性脊髓損傷傷動(dòng)物模型,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估了葒草苷在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)能否發(fā)揮作用,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較,進(jìn)行葒草苷給藥的大鼠BBB評(píng)分及斜板評(píng)分均增加,表明葒草苷可改善脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能。
總而言之,本研究表明葒草苷通過(guò)穩(wěn)定微管以促進(jìn)軸突再生,最終改善脊髓損傷后大鼠運(yùn)動(dòng)功能,這為治療脊髓損傷提供了新的策略,也為天然中草藥在脊髓損傷治療中的應(yīng)用提供了一定參考。但葒草苷如何增加微管穩(wěn)定性或是否存在其他機(jī)制促進(jìn)軸突再生,仍需進(jìn)一步研究。