萬淑瓊, 劉佳棟, 陳靜青, 謝 環(huán)

(1. 鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院, 湖北 黃石, 435200;2. 湖北省宜昌市第二人民醫(yī)院/三峽大學第二人民醫(yī)院 婦科, 湖北 宜昌, 443000)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)高發(fā)惡性腫瘤之一，早期癥狀較為隱匿，且侵襲力強、進展迅速[1], 雖然卵巢癌的診療手段近年來不斷發(fā)展，但治療后仍易復(fù)發(fā)，導(dǎo)致患者病死率較高，長期預(yù)后依然不佳[2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度在200個核苷酸以上且缺失或具有少量編碼蛋白能力的非編碼RNA, 可通過調(diào)控基因表達而在細胞增殖、生長、分化、代謝等多種生理過程中發(fā)揮重要作用[3], 參與多種疾病的發(fā)生過程[4], 同時與多種惡性腫瘤的發(fā)生、進展過程密切相關(guān)[5]。腫瘤易感候選基因11(CASC11)作為新近發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA, 在小細胞肺癌組織中表達異常且與預(yù)后有一定關(guān)系[6], 但其是否參與卵巢癌的發(fā)生與進展過程尚鮮有報道。本研究分析了卵巢癌組織中CASC11表達情況及其與不同臨床病理指標的關(guān)系，并通過小干擾RNA(siRNA)技術(shù)抑制SKOV3細胞中CASC11表達，觀察其對細胞生物學功能的影響，以期為卵巢癌的機制研究及早期診療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2019年12月在鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院婦科接受手術(shù)治療的104例卵巢癌患者作為研究對象，患者術(shù)前均未行放化療治療，且術(shù)后病理確診為卵巢上皮性癌?；颊吣挲g30～75歲，平均(49.38±10.37)歲; 組織學類型為漿液性61例，其他43例; 分化程度為中高分化67例，低分化37例; 國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期為Ⅰ～Ⅱ期48例, Ⅲ～Ⅳ期56例; 發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者48例。術(shù)中留取卵巢癌組織以及癌旁>2 cm正常癌旁組織，快速置于液氮中, -80 ℃保存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準，且所有患者均對研究知情同意。

1.2 主要試劑和設(shè)備

總RNA試劑(Trizol法)和Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司, CASC11和內(nèi)參引物由上海斯信生物科技有限公司設(shè)計合成, SKOV3細胞購自上海通派生物科技有限公司，達氏修正依氏培養(yǎng)基(DMEM)/F12培養(yǎng)液購自美國Sigma公司，胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司, CASC11干擾序列和陰性對照序列由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司設(shè)計合成，噻唑藍(MTT)購自廣東翁江化學試劑有限公司，二甲基亞砜(DMSO)購自上海一研生物科技有限公司, Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司, Transwell小室購自美國Corning公司, CFX-96實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR法檢測組織中CASC11表達情況: 取卵巢癌組織和癌旁正常組織，剪碎、研磨，按試劑盒說明提取總RNA并檢測純度，合格標準為A260/A280≥1.80。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 使用實時熒光定量PCR儀參照PCR擴增試劑盒說明對引物進行擴增。CASC11上游引物5′-GGTCCGAAGAAAGAGGAGTTAC-3′, 下游引物5′-TTTGTGTCTCGGTTCTCCATAG-3′; U6上游引物5′-CAGAGCTCCTCGTCTTGCC-3′, 下游引物5′-GTCGCCACCATGAGAGAC-3′。反應(yīng)條件為94 ℃ 2 min, 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 75 ℃ 30 s, 連續(xù)36個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算CASC11相對表達量。

1.3.2 細胞培養(yǎng)和分組: 應(yīng)用含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱對SKOV3細胞進行培養(yǎng)，胰酶消化對數(shù)生長期細胞，接種于6孔板, 2×105個/孔。將細胞分成3組，用Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染試劑分別對3組細胞進行轉(zhuǎn)染。① si-CASC11組，轉(zhuǎn)染CASC11基因的干擾序列為5′-GGAACTCACCAGCCAAGTT-3′; ② 陰性對照組，轉(zhuǎn)染陰性對照序列為5′-CAGCGCTGACAACAGTTTCAT-3′; ③ 空白組，僅加入轉(zhuǎn)染試劑，不進行其他處理。3組均繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.3 實時熒光定量PCR法檢測細胞中CASC11表達情況: 各組細胞于轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h時，胰酶消化，離心，取細胞沉淀，加入細胞裂解液，其余步驟同1.3.1。

1.3.4 MTT法檢測細胞增殖情況: 取各組細胞，胰酶消化，接種于96孔板，密度為2×103個/孔，分別于培養(yǎng)12、24、48、72、96 h時，將MTT液20 μL加入各孔，培養(yǎng)4 h, 將上清去除，各孔加入DMSO液150 μL, 充分振蕩20 min, 應(yīng)用酶標儀取450 nm波長對各孔吸光度(A)值進行檢測。重復(fù)實驗3次[7]。

1.3.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力: 各組細胞于轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h時，胰酶消化，接種于6孔板，密度為5×105個/孔，過夜培養(yǎng)，用200 μL移液槍槍頭垂直于孔板劃橫線，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，用不含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h或48 h，觀察并測量細胞遷移距離，計算細胞劃痕愈合率，公式為細胞劃痕愈合率=(初始劃痕寬度-24 h或48 h劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%[8]。

1.3.6 Transwell法檢測細胞侵襲能力: 用不含胎牛血清培養(yǎng)液稀釋基質(zhì)膠，平鋪在小室上室，過夜風干。各組細胞行胰酶消化，離心，用不含血清培養(yǎng)液重懸，密度5×105個/mL, 取200 μL加入上室，將含20%胎牛血清培養(yǎng)液600 μL加入下室，培養(yǎng)24 h, 將小室取出，多聚甲醛固定, 0.1%結(jié)晶紫染色, PBS沖洗3次，用棉簽除去散落細胞，鏡下觀察，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。重復(fù)實驗3次[9-10]。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 卵巢癌組織和癌旁正常組織中CASC11表達情況比較

卵巢癌組織中CASC11相對表達量為(1.89±0.14), 高于癌旁組織的(1.00±0.07), 差異有統(tǒng)計學意義(t=57.272,P<0.001)。

2.2 卵巢癌組織中CASC11表達與臨床病理指標的關(guān)系

卵巢癌組織中CASC11相對表達量在不同年齡、組織學類型和腹腔積液差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 而在不同分化程度、FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表1。

表1 卵巢癌組織中CASC11表達與臨床病理指標間的關(guān)系

2.3 轉(zhuǎn)染si-CASC11對細胞中CASC11表達的影響

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示, si-CASC11組、陰性對照組和空白組細胞中CASC11相對表達量分別為(0.22±0.11)、(0.98±0.06)和(1.02±0.12)。si-CASC11組細胞中CASC11相對表達量低于陰性對照組和空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001), 表明si-CASC11轉(zhuǎn)染能夠顯著抑制SKOV3細胞中CASC11的表達。見圖1。

2.4 抑制CASC11對SKOV3細胞增殖活性的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)24、48、72、96 h時, si-CASC11組A值均低于空白組、陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 培養(yǎng)12 h時, 3組A值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組細胞不同時點吸光度值比較

2.5 抑制CASC11對SKOV3細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示, si-CASC11組24、48 h時的細胞劃痕愈合率均低于陰性對照組、空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 表明抑制CASC11表達能夠顯著抑制SKOV3細胞的遷移能力。見表3、圖2。

表3 3組細胞劃痕愈合率比較 %

2.6 抑制CASC11對SKOV3細胞侵襲能力的影響

si-CASC11組侵襲細胞數(shù)為(85.67±6.47)個，低于陰性對照組的(121.17±6.65)個和空白組的(124.50±5.65)個，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01), 表明抑制CASC11表達能夠顯著抑制SKOV3細胞的遷移能力。見圖3。

3 討 論

卵巢癌是女性高發(fā)惡性腫瘤之一，病死率高，其發(fā)病機制復(fù)雜，涉及眾多遺傳及環(huán)境因素，至今尚未完全闡明。多項研究[11-12]提示，卵巢癌細胞惡性增殖及高侵襲轉(zhuǎn)移性與患者預(yù)后差密切相關(guān)。因此，積極尋找與卵巢癌生長及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵性基因有望為卵巢癌的精準診療及預(yù)后改善提供新的方向。近年來, lncRNA在腫瘤發(fā)生、進展中的作用越來越被重視，多種lncRNA參與了卵巢癌進程[13], 且與卵巢癌預(yù)后關(guān)系密切[14]。CASC11是新近發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA, 位于人染色體8q24.21,參與人體多種疾病的發(fā)生過程[15], 且在肝癌[16]、骨肉瘤[17]等多種惡性腫瘤組織中呈高表達，其可能參與了惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌組織中CASC11相對表達量高于癌旁正常組織，說明CASC11在卵巢癌組織中呈高表達，可能參與了卵巢癌發(fā)生過程。本研究還發(fā)現(xiàn), CASC11在低分化、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌組織中相對表達量明顯更高，進一步說明CASC11可能在卵巢癌進展中發(fā)揮重要作用。

為進一步明確CASC11在卵巢癌細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，本研究采用轉(zhuǎn)染干擾序列的方法特異性抑制卵巢癌SKOV3細胞中CASC11的表達，發(fā)現(xiàn)si-CASC11細胞中CASC11相對表達量相較于陰性對照組和空白組顯著降低，說明SKOV3細胞中CASC11表達被成功抑制。相關(guān)研究[18]指出, CASC11通過阻斷胃癌細胞周期，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。研究[19]指出, CASC11通過miRNA-150促進膀胱癌細胞增殖。本研究結(jié)果顯示，抑制CASC11表達可抑制SKOV3細胞增殖，提示CASC11可能參與了SKOV3細胞的增殖過程。相關(guān)研究[20]指出, CASC11通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進宮頸癌細胞的遷移和侵襲。SU X H等[21]指出, lncRNA CASC11可促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果提示，抑制CASC11表達可抑制SKOV3細胞遷移和侵襲力，提示CASC11可能參與了卵巢癌遷移和侵襲過程。

綜上所述，卵巢癌組織中CASC11呈高表達，且與惡性進展的臨床病理指標有關(guān)，抑制CASC11表達可抑制SKOV3細胞增殖、遷移和侵襲力，但其具體作用機制尚待進一步深入研究加以明確。