張海岳, 關(guān)經(jīng)緯, 王 族, 武 霄, 宋海慶, 孟 然

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 北京, 100053)

動脈粥樣硬化是缺血性腦卒中發(fā)病的重要原因[1]。動脈粥樣硬化可造成血管嚴(yán)重狹窄，對應(yīng)腦功能區(qū)域低灌注，還會導(dǎo)致病變血管內(nèi)湍流，易引起粥樣斑塊破裂或血栓形成，從而誘發(fā)缺血性腦卒中[2-3]。缺血性腦卒中發(fā)病早期即可出現(xiàn)一系列的炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)，特別是T細(xì)胞在卒中發(fā)生后24 h內(nèi)就被募集至腦損傷區(qū)域，是造成急性期神經(jīng)細(xì)胞損傷的主要免疫細(xì)胞[4-6]。此外，在缺血性腦卒中的早期階段，單核細(xì)胞在外周血中的分布也明顯增多[7]。

動脈粥樣硬化斑塊的形成主要是因膽固醇和膽固醇酯等脂質(zhì)成分的沉積。高密度脂蛋白(HDL)可促進(jìn)膽固醇從細(xì)胞內(nèi)流出，清除巨噬細(xì)胞內(nèi)多余的膽固醇，從而降低動脈粥樣硬化的發(fā)生率[8]。此外, HDL還具有抗炎和抗凋亡作用，在減緩動脈粥樣硬化進(jìn)展過程中發(fā)揮重要保護(hù)作用[9]。本研究分析急性期缺血性腦卒中患者HDL對免疫細(xì)胞分布的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年4月—2020年1月就診于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的急性缺血性腦卒中患者42例為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 年齡18～80歲者; ② 發(fā)病至醫(yī)院就診時(shí)間≤7 d者; ③ 磁共振彌散序列成像(MRI-DWI)確認(rèn)為新發(fā)缺血性腦卒中者; ④ 患者發(fā)病時(shí)間已超過取栓和溶栓時(shí)間窗，需轉(zhuǎn)入病房接受標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)科治療(治療方式參照中國缺血性腦卒中和短暫性腦缺血發(fā)作二級預(yù)防指南)。本研究通過了首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院倫理委員會的審查和批準(zhǔn)，并在納入研究前獲得了患者的知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 使用任何免疫抑制劑的患者; ② 患有免疫性疾病的患者; ③ 合并嚴(yán)重心臟、肝臟及脾臟疾病患者。所有患者均在入院后次日清晨空腹采集血標(biāo)本，并將所有血樣本進(jìn)行生化檢測，明確外周血HDL的表達(dá)水平，并進(jìn)一步行流式細(xì)胞分析。

1.2 流式細(xì)胞儀檢測

所有患者在接受治療前通過肘部采集外周血標(biāo)本，采用EDTA抗凝采血管收集2 mL新鮮靜脈血，輕輕搖勻，充分抗凝后及時(shí)送檢，行流式細(xì)胞儀檢測(BD LSRII, Becton Dickinson公司，美國)。

流式細(xì)胞儀檢測方法: ① 從每管獲取的血樣本中取100 μL抗凝全血放入流式管，按熒光抗體染色組合加入各自最佳使用量抗體。② 將血液與熒光標(biāo)記抗體均勻混合后室溫避光反應(yīng)20 min。③ 向每個(gè)樣品管中加入2 mL紅細(xì)胞裂解液(1x), 均勻混合后室溫避光孵育10 min。④ 將流式樣品管置于臺式離心機(jī)中, 300轉(zhuǎn)離心5 min, 棄上清。⑤ 向每個(gè)樣品管中加入2 mL 流式細(xì)胞洗液，混勻后放入臺式離心機(jī)中300轉(zhuǎn)離心5 min, 棄上清。⑥向每個(gè)樣品管中加入0.5 mL流式細(xì)胞洗液，混勻后4 ℃避光，及時(shí)采用流式細(xì)胞儀檢測分析。⑦ 采用美國BD LSR II型流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞群，并采用FACS Diva 6.1.3軟件分析細(xì)胞群數(shù)據(jù)。檢測的細(xì)胞群有: CD3+T細(xì)胞, CD3+CD4+T細(xì)胞, CD3+CD8+T細(xì)胞，單核細(xì)胞, CD14+CD16-單核細(xì)胞, CD14+CD16+單核細(xì)胞。本研究所使用抗體均購自BD Pharmingen (圣何塞，加利福尼亞州，美國)或BioLegend(圣地亞哥，加利福尼亞州，美國)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

本研究共納入42例符合標(biāo)準(zhǔn)的患者，根據(jù)外周血HDL水平的不同分為HDL<1.0 mmol/L組(n=22)和HDL≥1.0 mmol/L組(n=20)。

2.1 HDL對T淋巴細(xì)胞分布的影響

本研究分析了腦卒中患者HDL的基礎(chǔ)水平對急性期外周血中T淋巴細(xì)胞分布水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn), HDL<1.0 mmol/L組患者CD3+T淋巴細(xì)胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), HDL<1.0 mmol/L組患者CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1), 但CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞百分比低于HDL≥1.0 mmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047)。見圖1。

2.2 HDL對單核細(xì)胞分布的影響

本研究通過流式細(xì)胞儀分析了入組患者外周血中單核細(xì)胞的百分比，并分析了單核細(xì)胞的2種主要亞型CD14+CD16-單核細(xì)胞和CD14+CD16+單核細(xì)胞的百分比。結(jié)果顯示，在腦卒中急性期, HDL<1.0 mmol/L組和HDL≥1.0 mmol/L組患者外周血中總單核細(xì)胞、CD14+CD16-單核細(xì)胞和CD14+CD16+單核細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

2.3 傾向評分匹配后2組結(jié)果比較

鑒于真實(shí)世界中女性人群平均HDL水平高于男性人群[10], 本研究中HDL≥1.0 mmol/L組中女性患者的比率也高于男性。為了減少性別對于研究結(jié)果的影響，應(yīng)用SPSS 25.0軟件，以性別、陳舊性腦梗死病史、糖尿病作為協(xié)變量，匹配容差為0.05, 對2組進(jìn)行1∶1傾向性得分匹配分析，匹配后2組共有13對病例完成匹配，見表1。對于匹配后的13對患者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDL<1.0 mmol/L組患者CD3+T淋巴細(xì)胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L組(P=0.039), CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L組(P<0.0001), CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞百分比低于HDL≥1.0 mmol/L組(P=0.007), 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。HDL<1.0 mmol/L組和HDL≥1.0 mmol/L組患者外周血中總單核細(xì)胞、CD14+CD16-單核細(xì)胞和CD14+CD16+單核細(xì)胞的百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 匹配前后患者臨床資料比較

3 討 論

大量研究[9, 11]表明, HDL水平與動脈粥樣硬化和心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。HDL是膽固醇從細(xì)胞或外周組織中轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟內(nèi)代謝的主要載體，較高水平的HDL可減少膽固醇在動脈壁內(nèi)聚集，在動脈粥樣硬化病變進(jìn)程中發(fā)揮保護(hù)作用。目前研究[12-13]發(fā)現(xiàn)HDL還具有一定的抗氧化、抗組織增生、抗血栓等作用, HDL還可能在炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮額外的作用，包括抑制單核細(xì)胞活化和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，這些功能均有利于血管的抗動脈粥樣硬化作用。

缺血性腦卒中是目前導(dǎo)致人類高死亡和高致殘風(fēng)險(xiǎn)的主要疾病之一，也是神經(jīng)科學(xué)中病因機(jī)制研究的重點(diǎn)[14-15]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中患者發(fā)病早期即可出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。T細(xì)胞作為一類主要的免疫細(xì)胞，在缺血性腦卒中后的免疫反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用。BRAITV H等[16]研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中發(fā)病24 h后，在腦缺血區(qū)域及周圍梗死區(qū)域即可檢測到CD3+T淋巴細(xì)胞。動物實(shí)驗(yàn)研究[17]發(fā)現(xiàn)，在腦卒中發(fā)病后24～72 h, 在腦缺血區(qū)域可檢測到CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的招募和入侵，并且CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞在缺血性腦卒中患者發(fā)生炎癥反應(yīng)、腦組織損傷等過程中均發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)HDL<1.0 mmol/L組患者CD3+T淋巴細(xì)胞及CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L組患者，但CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞百分比低于HDL≥1.0 mmol/L組，表明HDL可減輕腦卒中患者急性期T淋巴細(xì)胞的入侵，并且主要通過減少CD3+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞的招募和入侵發(fā)揮腦保護(hù)作用，但是并不能抑制腦卒中后對CD3+CD8+T細(xì)胞的募集。

單核細(xì)胞可在急性腦卒中發(fā)生后4 h入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并在發(fā)病后7 d達(dá)到高峰[18]。單核細(xì)胞根據(jù)分化階段不同而分為多種亞型，其中人類最常見的亞型為CD14+CD16-單核細(xì)胞、CD14+CD16+單核細(xì)胞、CD16+CD14-單核細(xì)胞，這些不同亞型的單核細(xì)胞在腦卒中發(fā)生的不同階段發(fā)揮著不同的促炎和抗炎作用[7]。本研究發(fā)現(xiàn)在缺血性腦卒中急性期，HDL<1.0 mmol/L組和HDL≥1.0 mmol/L組患者外周血中總單核細(xì)胞、CD14+CD16-單核細(xì)胞和CD14+CD16+單核細(xì)胞的百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 表明HDL對于單核細(xì)胞的調(diào)控作用較小。

既往研究[10, 15]發(fā)現(xiàn)中國女性HDL表達(dá)水平高于男性，并且在女性絕經(jīng)期后HDL水平無明顯降低。此外，在真實(shí)世界研究[19]中，中國女性人群糖尿病發(fā)病率低于男性。本研究也發(fā)現(xiàn)HDL≥1.0 mmol/L組中女性比率較高，糖尿病比率較低，符合目前中國人群流行病學(xué)規(guī)律。為了去除性別和糖尿病對于研究結(jié)果的影響，本研究通過傾向性評分匹配分析的方法來去除這些混雜因素的影響，然后檢測2組間免疫細(xì)胞分布的差異。結(jié)果顯示, HDL<1.0 mmol/L組患者CD3+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞百分比高于HDL≥1.0 mmol/L組患者, CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞百分比低于HDL≥1.0 mmol/L組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HDL<1.0 mmol/L組和HDL≥1.0 mmol/L組患者外周血中總單核細(xì)胞、CD14+CD16-單核細(xì)胞和CD14+CD16+單核細(xì)胞的百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了在缺血性腦卒中急性期患者中，較高水平的HDL常伴隨有低水平的CD3+T淋巴細(xì)胞募集，并主要減少CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞的募集。雖然HDL≥1.0 mmol/L組患者外周血中CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞百分比高于HDL<1.0 mmol/L組患者，但是總CD3+T淋巴細(xì)胞百分比在HDL≥1.0 mmol/L組患者中偏低。由于CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞是CD3+T細(xì)胞發(fā)揮作用的2種主要亞型，因此HDL≥1.0 mmol/L組患者外周血CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞百分比的增加可能是因CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞的減少引起的反饋性增加，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，在缺血性腦卒中急性期患者中，較高水平的HDL常伴有低水平的CD3+、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞的募集，這種結(jié)果可能有利于減少缺血性卒中后的腦組織損傷。