夏 禎， 趙興聰， 王學東

（華東理工大學生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237）

豹蛙酶(Ranpirnase），商品名Onconase（ONC)，是全球正在研究的多種藥物之一[1-2]，最早分離自北極豹蛙(Northern Leopard Frog，Rana pipiens)的卵母細胞和早期胚胎[3]，屬于核糖核酸酶A(RNase A)超家族成員，是已知的胰核糖核酸酶超家族成員中最小的單結(jié)構(gòu)域蛋白。它是由104 個氨基酸殘基組成的一個相對分子質(zhì)量為11835、等電點為9.7 的蛋白質(zhì)。豹蛙酶能特異性地降解tRNA 抑制蛋白質(zhì)的合成[4]，細胞毒性較強, 可通過多種機制導致腫瘤細胞凋亡[5]，在體內(nèi)外對多種腫瘤細胞均具有顯著的殺傷作用[6-7]。臨床上豹蛙酶作為抗腫瘤藥物用于治療惡性間皮瘤，也用于非小細胞肺癌和其他固體腫瘤的治療并處于臨床研究階段，有著很大的應(yīng)用前景[8]。為了提高重組蛋白的表達水平，有必要對培養(yǎng)基和表達條件進行優(yōu)化[9]。目前，對于發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化已有許多研究，其中代志凱等[10]對近年來常用的試驗設(shè)計和優(yōu)化方法進行了綜述。于子玲等[11]用Plackett-Burman 實驗設(shè)計和Box-Behnken響應(yīng)面分析方法優(yōu)化了輔酶Q10 產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基。朱新術(shù)等[12]對重組畢赤酵母表達木聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，木聚糖酶的酶活力和比酶活分別達到了原來的3.055 倍和3.889 倍。本文通過對含有豹蛙酶基因的重組大腸桿菌E. coliBL21 (DE3)-pET- 22b (+)-ONC 進行培養(yǎng)、優(yōu)化誘導條件，并且利用Plackett-Burman (PB)實驗設(shè)計考察多個因素對豹蛙酶表達的影響，從而確定出最優(yōu)的培養(yǎng)方案，以提高豹蛙酶的表達量[13]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 重組菌E. coliBL21 (DE3)-pET- 22b (+)-ONC（豹蛙酶的NCBI 編號為P22069，基因序列為全基因合成。菌株為本實驗室構(gòu)建保存菌株）。

1.1.2 試劑 酵母粉（Yeast Extract）：安琪酵母股份有限公司；蛋白胨（Tryptone）：瑞軒生物制品公司；葡萄糖和培養(yǎng)基用無機鹽：國藥集團化學試劑有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)：上海國藥生物技術(shù)有限公司。文中所用試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，葡萄糖1，NaCl 5，Na2HPO41，KH2PO42.65，MgSO42，pH 7.2；培養(yǎng)基115 ℃滅菌30 min。補料培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖640；蛋白胨78，酵母粉10.78；115 ℃ 滅菌30 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌的培養(yǎng)和蛋白表達 將重組菌E. coliBL21 (DE3)-pET-22b (+)-ONC 接入4 mL 的LB 培養(yǎng)基（含100 μg/mL 的氨芐青霉素）中，37 ℃搖床培養(yǎng)8 h 活化種子。將活化后的種子液按2.5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基（含100 μg/mL 的氨芐青霉素）中，37 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)一定時間后加入一定濃度的IPTG 進行誘導表達，繼續(xù)培養(yǎng)8 ～10 h。

1.2.2 誘導條件優(yōu)化 應(yīng)用單因素實驗考察誘導劑濃度、誘導溫度、誘導前培養(yǎng)時間對重組大腸桿菌表達豹蛙酶的影響[14]。

1.2.3 Plackett-Burman 法 優(yōu) 化 重 組 菌 表 達 豹 蛙 酶 發(fā)酵培養(yǎng)基 Plackett-Burman 法是一種兩水平部分析因設(shè)計，可以利用少量的實驗篩選多個變量。并通過統(tǒng)計分析篩選出眾多因素中對實驗結(jié)果有顯著影響的因素，也可以不斷縮小因素的最優(yōu)值范圍，達到同時粗略優(yōu)化考察因素的作用[15]。

1.2.4 重組菌蛋白表達水平的確定 取發(fā)酵液50 mL于4 ℃、10 000 r/min 條件下離心20 min 收集菌體。棄去上清，沉淀中加入適量緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl ，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）重懸菌體，4 ℃下超聲破壁，然后于4 ℃、10 000 r/min 條件下離心40 min收集沉淀和上清，分別進行SDS-PAGE 分析，通過凝膠掃描成像儀分析電泳結(jié)果，得到目的蛋白占總蛋白的比例，即蛋白表達水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 誘導溫度對蛋白表達的影響 合適的誘導溫度既能保證微生物的正常生長，又能使外源基因得到正確的（可溶性）表達。將重組大腸桿菌置于37 ℃搖床下培養(yǎng)4 h，加入終濃度0.2 mmol/L 的IPTG，隨后分別置于25～37 ℃不同溫度的搖床中培養(yǎng)10 h，取樣測定各溫度下的菌濃，并按照蛋白表達量測定的方法考察重組大腸桿菌表達豹蛙酶的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)降低誘導培養(yǎng)溫度并不能提高可溶性表達量，蛋白主要以包涵體形式存在，而且降低溫度不利于重組菌的生長以及豹蛙酶表達。如圖1 所示，在誘導溫度37 ℃時，重組菌表達豹蛙酶的表達水平更高，達到8.3%，菌體密度也較高，OD600達到了4.80，所以設(shè)定大腸桿菌一般性的最適培養(yǎng)溫度37 ℃用于重組菌的后續(xù)實驗中。

圖1 誘導溫度對重組菌生長以及表達豹蛙酶的影響Fig. 1 Effect of induction temperature on the growth and expression of ranpirnase of recombinant E. coli

2.1.2 誘導劑濃度對蛋白表達的影響 增加誘導劑IPTG 濃度可以提高誘導強度，提升蛋白表達水平，但同時對微生物細胞具有一定的毒性[16]，因此，誘導劑合適的添加濃度對重組蛋白表達非常重要。將重組大腸桿菌在37 ℃搖床培養(yǎng)4 h，然后分別向搖瓶中添加終濃度范圍為0.1～1.2 mmol/L 的IPTG，并且于37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)10 h，分別取樣測定其菌濃和豹蛙酶的表達水平，結(jié)果如圖2 所示。隨著誘導劑濃度的升高，豹蛙酶的表達水平總體上表現(xiàn)為先增后減的趨勢，而菌體生長總體上則呈現(xiàn)逐步增加的抑制效果。實驗結(jié)果表明當IPTG 終濃度在0.9 mmol/L 時表達水平最高，可達到11.6%。但是在此條件下的細胞生長水平則比較差；而在IPTG 終濃度0.2 mmol/L的條件下細胞有一個適中的表達水平，同時該終濃度對細胞生長無明顯抑制；從重組菌的生長情況、表達情況與成本方面綜合考慮，最終選擇0.2 mmol/L為后續(xù)實驗中IPTG 的終濃度。

圖2 誘導濃度對重組菌生長以及表達豹蛙酶的影響Fig. 2 Effect of induction concentration on the growth and expression of ranpirnase of recombinant E. coli

2.1.3 誘導前培養(yǎng)時間對蛋白表達的影響 因為IPTG 對菌體生長和蛋白表達有雙重影響，所以誘導劑加入的時機是影響總的菌體蛋白表達的重要影響因素。將重組大腸桿菌置于37 ℃搖床下培養(yǎng)不同時間后分別加入終濃度為0.2 mmol/L 的IPTG 誘導劑，繼續(xù)誘導培養(yǎng)10 h，分別取樣測定各實驗組的菌濃和豹蛙酶的表達水平，結(jié)果如圖3 所示。隨著誘導前培養(yǎng)時間的增加，重組菌表達豹蛙酶的表達水平總體上呈現(xiàn)先增后減的趨勢，而菌濃則總體上稍有上升。誘導前培養(yǎng)3 h，表達水平最高可達9.4%。這是因為在1～3 h，重組菌進入生長對數(shù)期，此時菌體活力較強，誘導對重組菌表達較好。所以選擇3 h 作為后續(xù)實驗的誘導前培養(yǎng)時間。

圖3 誘導前培養(yǎng)時間對重組菌生長以及表達豹蛙酶的影響Fig. 3 Effect of culture time before induction on the growth and expression of ranpirnase of recombinant E. coli

2.2 Plackett-Burman 法優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基結(jié)果

在上述最適培養(yǎng)和誘導條件下，進一步優(yōu)化重組大腸桿菌表達豹蛙酶的最優(yōu)培養(yǎng)基組成。實驗采用Plackett-Burman 設(shè)計方法，篩選對重組大腸桿菌表達豹蛙酶(菌體總密度及豹蛙酶的表達量)影響最為顯著的發(fā)酵培養(yǎng)基成分因素[17]。采用葡萄糖、甘油、蛋 白 胨、酵 母 粉、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4、ZnSO4、CaCl2、(NH4)2SO4、MnSO4、FeCl3、CoCl2、CuSO4、Na2B4O7作為Plackett-Burman 實驗的研究因素，考察了上述因素對菌體量和豹蛙酶表達水平的影響情況。經(jīng)過預實驗最終從上述因素中選取了12 個因素和2 個虛擬變量進一步考察它們對重組菌表達豹蛙酶的影響(表1)，并得到結(jié)果(表2)進行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

表1 Plackeet-Burman 實驗設(shè)計因素水平表Table 1 Levels of selected factors for Plackeet-Burman

表2 Plackeet-Burman 實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Plackeet-Burman

續(xù)表2

數(shù)據(jù)結(jié)果采用實驗設(shè)計軟件Design-Expert 進行回歸方程分析，得到各影響因素的效應(yīng)值(F值)以及顯著性(Prob>F值)（表3）。效應(yīng)值可用來反映各個考察因素對于整體的影響。效應(yīng)值越大則表示該因素對于整體的影響越大，而效應(yīng)值越接近零則表明該因素對于整體的影響越小。各因素的顯著性由Prob>F來決定。當Prob>F的值小于0.05 時表示該因素的效果顯著(置信區(qū)間選擇95%)，當Prob>F的值大于0.1 時則表示這個因素的效果不顯著。因此，當通過Plackett-Burman 實驗篩選影響因素時，既要考慮因素的效應(yīng)值也要考慮因素顯著性。

表3 Plackett-Burman 實驗回歸分析結(jié)果Table 3 Regression analysis results of Plackett-Burman design

根據(jù)實驗數(shù)據(jù)分析可知，在實驗選取的濃度范圍內(nèi)，Zn2+、Mn2+、Mg2+、NaCl、Ca2+、KH2PO4、蛋白胨對重組大腸桿菌表達豹蛙酶的總蛋白量有顯著影響。通過Plackett-Burman 實驗確定了影響重組菌表達豹蛙酶的顯著因素以及影響因素最適的大致范圍，但由于因素之間關(guān)聯(lián)性不強，所以沒有再進一步進行響應(yīng)面優(yōu)化實驗，而是綜合幾次Plackett-Burman實驗結(jié)果確定最優(yōu)培養(yǎng)基組成（g/L）為：蛋白胨10，酵母粉4，葡萄糖1，(NH4)2SO45，NaCl 15，Na2HPO41.6，KH2PO44 ，MgSO44 ，CaCl20.5 ，MnSO40.2，F(xiàn)e2(SO4)30.3，ZnSO40.3。

用上述優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶實驗驗證，結(jié)果見圖4。采用凝膠掃描成像儀分析電泳結(jié)果，可知豹蛙酶表達水平由優(yōu)化前的9%提高到優(yōu)化后的36%，采用分光光度計測得OD600值由優(yōu)化前的4.80 提升到優(yōu)化后的5.47，可見蛋白表達水平和菌體生長情況都得到了改進。

圖4 搖瓶水平上優(yōu)化前后重組菌表達豹蛙酶情況Fig. 4 Expression of ranpirnase in recombinant E. coli before and after optimization at shake flask level

2.3 發(fā)酵罐試驗結(jié)果

為得到大量的重組豹蛙酶，并驗證搖瓶水平所得重組菌表達條件的優(yōu)化結(jié)果，在7 L 發(fā)酵罐中進行了發(fā)酵表達試驗。使用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基和誘導條件，接種量為2%。接種后，根據(jù)實際的溶氧變化控制攪拌轉(zhuǎn)速、空氣通量使溶氧保持在20%以上，發(fā)酵過程中自動調(diào)節(jié)pH，使其保持在7.0[18]。前期菌體生長階段采用指數(shù)補料方式，補料速率根據(jù)菌體的生長狀況實時調(diào)整，待菌體濃度達到OD600=20 時，加入終濃度0.2 mmol/L 的IPTG 誘導表達，誘導階段采用pH-stat 的控制方式[19-20]，再在37 ℃下誘導培養(yǎng)9～10 h，收集發(fā)酵液，SDS-PAGE 電泳測定豹蛙酶的表達量，結(jié)果見圖5。觀察全細胞、細胞破碎后上清液、細胞破碎后沉淀電泳結(jié)果可知，豹蛙酶主要以包涵體形式存在，其中包涵體占95%以上。優(yōu)化后發(fā)酵罐中重組菌對豹蛙酶的表達水平可達到55%，搖瓶水平上的優(yōu)化得到了很好的驗證。除表達水平外，重組菌在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長更好，采用分批補料發(fā)酵能夠獲得更高的的菌濃，OD600提高到35，且菌體易于離心、不易自溶，更加穩(wěn)定。

圖5 發(fā)酵罐水平優(yōu)化后重組菌表達豹蛙酶情況Fig. 5 Expression of ranpirnase by recombinant E.coli after optimization of fermentor

3 結(jié) 論

通過單因素實驗對豹蛙酶表達的誘導溫度、誘導劑濃度以及誘導前培養(yǎng)時間進行優(yōu)化，綜合實驗結(jié)果并考慮生產(chǎn)成本最終確定誘導溫度為37 ℃，誘導劑濃度為0.2 mmol/L，誘導前培養(yǎng)時間為3 h。通過Plackett-Burman 法優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶水平上豹蛙酶表達量由優(yōu)化前的9%提高到優(yōu)化后的36%，OD600值由優(yōu)化前的4.80 提升到優(yōu)化后的5.47。以此為基礎(chǔ)，在7 L 發(fā)酵罐上采用分批補料方式進行重組豹蛙酶發(fā)酵表達，表達水平可達到55%，OD600值可達到35。優(yōu)化結(jié)果對重組菌生產(chǎn)豹蛙酶的工業(yè)應(yīng)用有很好的借鑒作用。