馮 濤， 夏建業(yè)， 儲 炬

（1. 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237；2. 國藥集團(tuán)威奇達(dá)藥業(yè)有限公司，山西大同 037300）

在微生物發(fā)酵的整個過程中，反應(yīng)器的混合、傳質(zhì)和剪切是影響發(fā)酵過程的3 個流場特征參數(shù)，這些參數(shù)與微生物發(fā)酵過程相關(guān)聯(lián)，因此反應(yīng)器內(nèi)流場結(jié)構(gòu)對于微生物發(fā)酵起著至關(guān)重要的作用，是反應(yīng)器設(shè)計和發(fā)酵過程優(yōu)化中的一項重要技術(shù)[1]。工業(yè)發(fā)酵開發(fā)過程離不開搖瓶，菌種篩選、培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵條件等都在搖瓶中進(jìn)行。此外，種子的培養(yǎng)條件優(yōu)化可通過搖瓶進(jìn)行培養(yǎng)放大[2]。因此，搖瓶內(nèi)的流場結(jié)構(gòu)對菌種篩選、培養(yǎng)基優(yōu)化、種子培養(yǎng)條件優(yōu)化、發(fā)酵培養(yǎng)工藝放大等有十分重要的指導(dǎo)作用[3-4]。

克拉維酸(Clavulanic Acid, CA)是由棒狀鏈霉菌（Streptomyces clavuligerus）經(jīng)過好氧發(fā)酵產(chǎn)生的一種次級代謝產(chǎn)物，它是一種高效的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑。據(jù)報道克拉維酸發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳氮源為大豆蛋白[5-6]，最佳碳源為甘油[7-8]，由于發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分比例較高，在發(fā)酵過程中發(fā)酵液黏度較高，嚴(yán)重影響發(fā)酵過程的氣液傳質(zhì)效果，從而影響克拉維酸的生物合成。

在液體發(fā)酵過程中，溶解氧的供給是合成克拉維酸分子的必要前提[9]，這就要求進(jìn)行克拉維酸發(fā)酵的反應(yīng)器內(nèi)有較強(qiáng)的攪拌混合作用和足夠的供氧能力，以滿足克拉維酸高效合成中高耗氧的需求。由于棒狀鏈霉菌為放線菌，隨著菌絲的生長，菌絲會出現(xiàn)結(jié)網(wǎng)現(xiàn)象，導(dǎo)致發(fā)酵液黏度明顯增加，高耗氧、高黏度是克拉維酸發(fā)酵過程的一個顯著特點。為保證克拉維酸的正常合成，工業(yè)生產(chǎn)中在攪拌轉(zhuǎn)速達(dá)到最高速度后，往往被迫通過提高罐壓、降溫等措施來降低代謝活力以滿足代謝最低要求[10-12]。因此，通過優(yōu)化攪拌和設(shè)備參數(shù)，加強(qiáng)氣液傳質(zhì)，改善發(fā)酵微環(huán)境是優(yōu)化克拉維酸發(fā)酵的研究方向。

本文運用計算流體力學(xué)（CFD）對帶檔板與不帶擋板的3 L 搖瓶內(nèi)的流場結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)模擬，并根據(jù)模擬結(jié)果對其中的種子培養(yǎng)過程及發(fā)酵過程分別進(jìn)行分析，為進(jìn)一步放大克拉維酸發(fā)酵過程提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

棒狀鏈霉菌（Streptomyces clavuligerus），由國藥集團(tuán)威奇達(dá)藥業(yè)有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基主要成分：甘油、豆餅粉、糊精。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 至7.0，在121 ℃下滅菌30 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分：黃豆餅粉、甘油、淀粉、嗎啉丙磺酸（MOPS）、三油酸甘油酯、K2HPO4及微 量 元 素（ NaCl 0.100 g/L，MgCl20.100 g/L，CaCl2·2H2O 0.100 g/L，F(xiàn)eCl30.030 g/L，CuCl20.005 g/L，MnSO40.005 g/L，ZnCl20.005 g/L，ZnSO40.065 g/L）；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 至6.9，在121 ℃下滅菌30 min。

1.3 培養(yǎng)條件

搖瓶種子培養(yǎng)：將解凍后的孢子懸液0.5 mL 接種于100 mL 種子培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，搖床轉(zhuǎn)速為（160±10）r/min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將0.25 mL 種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)168 h，搖床轉(zhuǎn)速為（160±10）r/min。

搖床：旋轉(zhuǎn)振蕩搖床，型號SPH-322D，振幅Φ100 mm，購自上海世平實驗設(shè)備有限公司。

顯微鏡：Olympus BX-53，顯微成像系統(tǒng)Cellsens。

1.4 帶擋板與不帶擋板的3L 培養(yǎng)用搖瓶

三角搖瓶是實驗室進(jìn)行發(fā)酵工藝研究最便利的生物反應(yīng)器，它也被用在克拉維酸搖瓶工藝開發(fā)過程中[13-15]。搖瓶內(nèi)流場結(jié)構(gòu)的充分解析，對理解工業(yè)發(fā)酵罐克拉維酸發(fā)酵工藝具有十分重要的研究價值。本文使用的三角搖瓶全容積3 L，購自博美玻璃儀器廠。帶有一個擋板的搖瓶如圖1 所示。

圖1 帶一個擋板的3 L 搖瓶Fig. 1 3 L Flask with one baffle

1.5 搖瓶流場的CFD 模型

搖瓶在搖床上的運動是一種繞轉(zhuǎn)動軸轉(zhuǎn)動的特殊公轉(zhuǎn)，并且轉(zhuǎn)動過程中瓶身前后左右各面的方位不變（設(shè)前后左右表面分別對應(yīng)南（S）北（N）西（W）東（E）4 個方位，在公轉(zhuǎn)過程中這幾個方位保持不變）。在CFD 模型中不能通過簡單的繞軸運動對此運動進(jìn)行模擬，因為瓶體中不同位置的流體微團(tuán)在同一時刻受到的轉(zhuǎn)動離心力是不同的，需要對其進(jìn)行建模。

以上運動可以看作是搖瓶不動，而搖瓶內(nèi)的發(fā)酵液流體微元均受到重力及繞該流體微元周期性運動的離心力的共同作用?；诖耍赏ㄟ^以下模型對每個流體微元進(jìn)行受力分析。如圖2 所示，搖瓶中發(fā)酵液流體微元各自繞其固定的軸作旋轉(zhuǎn)運動，旋轉(zhuǎn)角速度為 ω ，旋轉(zhuǎn)半徑為r，流體微元同時受到離心力fc及重力fg的作用，并且滿足：

圖2 搖瓶運動過程中發(fā)酵液流體微元受力分析Fig. 2 Analysis of the fluid micro-element force in the fermentation liquid during shake flask movement

這樣搖瓶內(nèi)流體共受到3 個方向的質(zhì)量力的作用，相應(yīng)的加速度為：

1.6 搖瓶流場中氣液傳質(zhì)數(shù)值模型

1.7 搖瓶氣液兩相流場模擬

采用Euler-Euler 法對搖瓶內(nèi)的氣液兩相流動進(jìn)行建模，氣相和液相均作為連續(xù)相處理，按照培養(yǎng)基裝量位置對流場進(jìn)行初始化，此交界面以下為液體，交界面以上為氣體。搖瓶內(nèi)氣液兩相流動形成的自由表面通過流體體積法（VOF）進(jìn)行追蹤。

搖瓶內(nèi)流體網(wǎng)格采用Ansys ICEM CFD 生成，利用四面體網(wǎng)格進(jìn)行劃分，最大網(wǎng)格尺寸小于5 mm，不帶擋板搖瓶中共生成40 萬網(wǎng)格，帶擋板搖瓶中生成60 萬網(wǎng)格。

流場建模及數(shù)值模擬在Ansys CFX12.0 中進(jìn)行，湍流模型選用k-ε 雙方程模型。

2 結(jié)果與討論

2.1 搖床上搖瓶周期性旋轉(zhuǎn)運動形成流場的模擬

搖床的運動是振蕩（Shaking）而不是旋轉(zhuǎn)（Rotation），其工作原理如圖3 所示。因此，對搖床上安裝的搖瓶內(nèi)流體運動的模擬不能采用簡單的繞軸旋轉(zhuǎn)進(jìn)行建模，應(yīng)該在考慮搖瓶繞軸1 公轉(zhuǎn)外，同時考慮搖瓶繞自身軸心（軸2）的反向自轉(zhuǎn)。為探究可用于模擬搖瓶中流體流動的真實模型，分別比較了單純繞軸1 公轉(zhuǎn)的模擬結(jié)果，以及利用1.5 節(jié)中討論的模型算法模擬搖瓶的運動。

圖3 搖床運動原理示意圖Fig. 3 Schematic diagram of shaker movement principle

模擬結(jié)果顯示，采用單純繞軸1 的旋轉(zhuǎn)無法模擬發(fā)酵液在搖瓶內(nèi)的真實運動。在形成一個相對穩(wěn)定的傾斜方向朝向旋轉(zhuǎn)軸的自由表面的流動狀態(tài)下，不存在流體微元間的相對運動，使得混合和相間傳質(zhì)較小，完全不符合真實搖瓶中的發(fā)酵液流動[18-19]。真實情況下，搖瓶在繞搖床旋轉(zhuǎn)中心軸運動的同時以相同大小的角速度逆向自旋，從而保持前后左右各面方位不變。運用文中提出的旋轉(zhuǎn)離心加速度模型對搖瓶進(jìn)行模擬，如圖4 所示。

圖4 利用本文提出的旋轉(zhuǎn)離心加速度模型模擬得到的不同時刻氣液流動自由表面（80 r/min）Fig. 4 Gas-liquid flow free surface at different time by the rotational centrifugal acceleration model proposed in this paper (80 r/min)

2.2 不同轉(zhuǎn)速下?lián)醢褰Y(jié)構(gòu)對搖瓶中流場結(jié)構(gòu)的影響

通過CFD 模擬，比較了帶檔板與不帶擋板的3 L搖瓶中形成的流場。重點考察了不同攪拌轉(zhuǎn)速對搖瓶中形成的氣液交界面面積、氣液比表面積、平均液膜傳質(zhì)系數(shù)（平均kL）以及平均kLa的影響，如圖5 所示。從圖5 可以看出，在較低轉(zhuǎn)速（40 r/min）下，擋板結(jié)構(gòu)對以上參數(shù)均無顯著影響。隨著轉(zhuǎn)速增加（80～160 r/min），同轉(zhuǎn)速下帶擋板的搖瓶內(nèi)比不帶擋板的搖瓶內(nèi)形成的氣液交界面面積和氣液比表面積明顯更大。而對于平均kL，擋板的作用則更加復(fù)雜。隨著轉(zhuǎn)速增加，帶擋板和不帶擋板的搖瓶內(nèi)平均kL呈現(xiàn)出不同的變化趨勢，80 r/min 轉(zhuǎn)速下，不帶擋板搖瓶中平均kL明顯優(yōu)于帶擋板搖瓶中平均kL；轉(zhuǎn)速再增加時（120～160 r/min），擋板對平均kL的提升作用明顯，不帶擋板搖瓶中平均kL沒有出現(xiàn)提升作用，反而相對80 r/min 下的平均kL有所下降。綜合來看，帶檔板搖瓶內(nèi)kLa隨轉(zhuǎn)速的增幅明顯大于不帶擋板搖瓶內(nèi)kLa的增幅，并且轉(zhuǎn)速越高增幅越明顯。

圖5 不同轉(zhuǎn)速下帶檔板與不帶擋板搖瓶中傳質(zhì)參數(shù)流場預(yù)測值對比（裝液量600 mL）Fig. 5 Comparison of flow field prediction values of mass transfer parameters between shaker flask with baffle and without baffle at different speeds (filling volume 600 mL)

通過進(jìn)一步比較不同轉(zhuǎn)速下?lián)u瓶內(nèi)的流場結(jié)構(gòu)，尤其是氣液交界自由表面的流場結(jié)構(gòu)，可以更直觀地研究擋板結(jié)構(gòu)對搖瓶中流場結(jié)構(gòu)的影響。圖6比較了不同轉(zhuǎn)速下帶檔板和不帶擋板搖瓶內(nèi)氣液兩相流動時的氣液交界自由表面形貌。采用相同顏色標(biāo)尺來表示流場中kLa的大小分布，紅色表示kLa最大值，藍(lán)色表示kLa最小值，其他顏色表示kLa介于兩者之間。從圖6 可以直觀地看出，同樣轉(zhuǎn)速下帶擋板搖瓶中形成的自由表面具有更多褶皺，而不帶擋板搖瓶中形成的自由表面更加光滑，這就是氣液交界面面積在帶擋板搖瓶中更大的原因[20]。

圖6 不同轉(zhuǎn)速下帶檔板和不帶擋板搖瓶中形成的氣液自由表面對比Fig. 6 Comparison of gas-liquid free surface formed by shaking flask with baffle and without baffle at different rotating speeds

模擬結(jié)果顯示，最大kLa往往分布在氣液自由表面沿旋轉(zhuǎn)方向的尾部邊緣，最小kLa則大多分布在沿旋轉(zhuǎn)方向前沿的內(nèi)部區(qū)域。文獻(xiàn)[21]報道旋轉(zhuǎn)搖瓶中的氣液傳質(zhì)多發(fā)生在液體在搖瓶壁面劃過后形成的薄層液膜中，按此理論氣液傳質(zhì)應(yīng)該在自由表面劃過的尾部最為劇烈，這與本文的研究結(jié)果一致。

表1 示出了不同轉(zhuǎn)速下帶檔板與不帶擋板搖瓶中平均剪切應(yīng)變率Y˙ 大小的比較。從表1 可以看出在較低的轉(zhuǎn)速（40 r/min）下兩者平均剪切應(yīng)變率相對偏差不大（2%）外，在80、120、160 r/min 轉(zhuǎn)速下帶檔板搖瓶比不帶檔板搖瓶相對偏差平均值高出27.3%。較高的平均剪切應(yīng)變率一方面促進(jìn)了氣液傳質(zhì)與混合能力，同時也為菌絲體斷裂形成更多分支提供了有利條件。

表1 不同轉(zhuǎn)速下帶檔板與不帶檔板搖瓶中平均剪切應(yīng)變率（SSR）大小對比Table 1 Comparison of average shear strain rate (SSR) in shaking flask with and without baffle at different rotational speeds

2.3 不同裝液量下帶檔板搖瓶中的模擬分析

進(jìn)一步考察帶擋板結(jié)構(gòu)的搖瓶中裝液量對流場參數(shù)的影響，如圖7 所示。由圖可見裝液量對平均kL（圖7（c））的影響較對氣液交界面面積（圖7（a））的影響明顯，隨著裝液量的增加平均kL增加幅度遠(yuǎn)大于氣液交界面面積增幅。圖7（b）中，隨著裝液量增加氣液比表面積迅速降低。綜上，隨著裝液量增加平均kLa先增大后降低（圖7（d）），在所考察的轉(zhuǎn)速下最優(yōu)裝液量為650 mL 左右。這與發(fā)酵實驗得到的結(jié)果一致。

圖7 帶檔板搖瓶中不同裝液量下流場參數(shù)CFD 模擬預(yù)測值（搖床轉(zhuǎn)速120 r/min）Fig. 7 CFD simulation prediction value of flow field parameters under different liquid loading in shaking flask with gear plate (rotating speed of shaking table 120 r/min)

2.4 搖瓶中流場對克拉維酸種子培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)的影響

為驗證CFD 模擬結(jié)果，在不帶擋板搖瓶及帶檔板搖瓶中分別進(jìn)行了種子培養(yǎng)過程及發(fā)酵培養(yǎng)過程的實驗研究。

帶檔板搖瓶及不帶擋板搖瓶中克拉維酸種子培養(yǎng)過程的實驗對比如圖8 所示。由圖8（b）可知，帶檔板搖瓶中菌體量明顯小于不帶擋板搖瓶菌體量。該結(jié)果驗證了同樣操作條件下，由于擋板結(jié)構(gòu)的存在使流場中形成更大的剪切作用，從而細(xì)胞的表觀比生長速率受到抑制，形成了相對較低的菌體濃度。培養(yǎng)結(jié)束前即使在菌濃相對較低的狀態(tài)下，帶檔板搖瓶中美蘭褪色時間仍比不帶擋板搖瓶褪色時間短（圖8（c）），充分說明了帶檔板搖瓶中氣液傳質(zhì)能力更高，從而表現(xiàn)出更高的克拉維酸生產(chǎn)能力，導(dǎo)致更高的發(fā)酵液黏度（圖8（d））。

圖8 帶檔板與不帶擋板搖瓶中種子培養(yǎng)過程參數(shù)變化對比Fig. 8 Comparison of seed culture parameters in shaking flask with baffle and without baffle

進(jìn)一步比較了帶檔板和不帶檔板3 L 搖瓶中克拉維酸發(fā)酵培養(yǎng)過程，研究了裝液量分別為150、250、500、650、900 mL 時的菌絲變化，在1000 倍顯微鏡下觀察并記錄菌絲特征，見表2 和圖9。經(jīng)過對比菌絲分支程度、內(nèi)涵物顆粒發(fā)現(xiàn)，隨著裝液量的增加，兩種搖瓶中均出現(xiàn)不同程度的供氧不足，菌絲形態(tài)出現(xiàn)了顯著的差異。帶有擋板的搖瓶，前期生長階段菌絲快速生長并伴隨大量分支，當(dāng)裝液量大于650 mL時，菌絲有少量結(jié)團(tuán)；而沒有擋板的搖瓶，在相同裝液量的情況下，菌絲快速生長易形成團(tuán)球，導(dǎo)致氧和營養(yǎng)物質(zhì)無法傳遞至菌團(tuán)內(nèi)部，影響菌團(tuán)內(nèi)菌絲正常代謝。通過對比培養(yǎng)后期菌絲特征，可以看出帶有擋板的搖瓶中，菌絲呈現(xiàn)明顯的次級代謝特征，菌絲分化斷裂伴隨有內(nèi)含物的積累。整個過程菌絲的形態(tài)變化進(jìn)一步證明了檔板結(jié)構(gòu)更容易形成較大剪切，促使培養(yǎng)前期菌絲產(chǎn)生更多分支，加速前期菌絲快速生長，從而有利于培養(yǎng)后期的菌絲分化。

圖9 3 L 帶擋板與不帶擋板搖瓶中克拉維酸發(fā)酵菌絲形態(tài)（裝液量650 mL，培養(yǎng)120 h）Fig. 9 Clavulanic acid mycelium morphology in 3 L flask with baffle and without baffle (Filling volume 650 mL, cultivation 120 h)

表2 帶檔板和不帶擋板搖瓶中不同裝液量下菌絲形態(tài)對比（培養(yǎng)120 h）Table 2 Comparison of mycelium morphology under different filling volume in shake flasks with baffle and without baffle (cultivation 120 h)

圖10 示出了帶擋板和不帶擋板搖瓶中裝液量對克拉維酸發(fā)酵的影響，隨著裝液量的增加，兩種搖瓶表現(xiàn)出明顯相反的克拉維酸合成量變化趨勢。隨著裝液量的增加，無擋板搖瓶中克拉維酸合成量呈下降趨勢；而帶擋板搖瓶正好相反，克拉維酸合成量隨裝液量增加而增加，當(dāng)裝液量為650 mL 時，克拉維酸合成量達(dá)到最高值，當(dāng)裝液量繼續(xù)增大克拉維酸合成量不增反降。由前面流場分析可知，發(fā)酵液中氣液傳質(zhì)能力的差異主要是由兩種規(guī)格搖瓶中氣液傳質(zhì)能力差異引起的。2.3 節(jié)不同裝液量下帶擋板搖瓶中的模擬結(jié)果也表明，帶擋板搖瓶中平均kLa隨著裝液量增加而增加，當(dāng)裝液量大于650 mL時平均kLa不再增加，因而克拉維酸合成量不再增加。

圖10 帶檔板與不帶擋板搖瓶中裝液量對克拉維酸發(fā)酵的影響Fig. 10 Effect of filling volume in shaking flask with baffle and without baffle on clavulanic acid fermentation

3 結(jié)束語

本文提出了一種用于模擬搖瓶在搖床上運動的計算流體力學(xué)模型，采用周期性旋轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)加速度來模擬搖瓶運動對其內(nèi)流體運動的驅(qū)動力，從而真實地模擬了流體旋轉(zhuǎn)形成的氣液交界的自由表面。

利用搖瓶氣液兩相流的模型，分別在不同搖床轉(zhuǎn)速、裝液體積情況下，對搖瓶內(nèi)形成的流場進(jìn)行了詳細(xì)模擬研究，分別考察了以上因素對氣液交界面面積大小、比表面積大小、液膜傳質(zhì)系數(shù)、剪切力大小、以及平均氣液傳質(zhì)能力的影響。結(jié)果表明：裝液量不變情況下，平均體積氣液傳質(zhì)系數(shù)隨著轉(zhuǎn)速增加而增大，且加裝擋板對傳質(zhì)能力提升明顯；形成的剪切力也隨著轉(zhuǎn)速增加而增加，且?guī)醢鍝u瓶的剪切力明顯大于不帶擋板搖瓶的剪切力，這也解釋了帶檔板搖瓶對克拉維酸種子培養(yǎng)和發(fā)酵具有促進(jìn)作用的原因；進(jìn)一步考察裝液量對流場結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明轉(zhuǎn)速大小對剪切力的影響遠(yuǎn)大于裝液量的作用，不同裝液量下幾乎得到相同的剪切力，但是特定轉(zhuǎn)速下存在與之相統(tǒng)一的最優(yōu)的裝液量。

帶檔板搖瓶中形成的相對高的剪切力及相對充足的供氧條件為克拉維酸發(fā)酵提供了更好的流場條件，即供給足量的氧氣分子參與克拉維酸分子的生物合成，同時也提供了有利于菌絲分支數(shù)提高的剪切環(huán)境。本文從流場研究的角度揭示了流場結(jié)構(gòu)對于發(fā)酵過程的重要影響，從而提供了一種用于優(yōu)化搖瓶培養(yǎng)條件的數(shù)值模擬方法，該方法可推廣到其他發(fā)酵產(chǎn)品。