竺婷婷， 袁慧慧， 胡瑾怡， 藍(lán)閩波

（華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

海綿占海洋生物物種的6.7%，其結(jié)構(gòu)獨(dú)特、活性優(yōu)異的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]是海洋藥物先導(dǎo)物的重要來源之一。海綿Pseudoceratinasp.屬于Verongida 目Aplysinellidae Bergquist 科[2]，廣泛地分布在澳大利亞大堡礁[3]和南澳海域[4]、加勒比海[5]、瓦努阿圖海[6]、日本沖繩島[7]及中國南海海域[8-9]。該屬海綿的化學(xué)成分以溴代衍生物為代表，顯示出多種生物活性，如殺瘧原蟲活性、廣譜的抗菌性、抗腫瘤活性，以及作為小分子抑制劑治療癌癥、纖維化和其他疾病等。

本文目的是以腫瘤細(xì)胞毒活性為導(dǎo)向，在我國南海海綿Pseudoceratinasp.中分離和篩選出具有高活性的化學(xué)成分。在天然產(chǎn)物的藥用活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)過程中，除了基礎(chǔ)的細(xì)胞試驗(yàn)外，當(dāng)?shù)玫侥硞€(gè)結(jié)構(gòu)明確的化合物，可通過綜合評(píng)估化合物和靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的相關(guān)性、活性基團(tuán)的類型等因素，對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行排序，通過靶標(biāo)已知的效用篩選與化合物活性作用相關(guān)的靶標(biāo)，分析和預(yù)測可能的靶標(biāo)，最后進(jìn)行驗(yàn)證，從而大大提高活性物質(zhì)的篩選效率。文獻(xiàn)[10]在利用軟件SHAFTS[11]在計(jì)算化合物3D 分子相似性的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)開發(fā)了Chemmapper Server，在ChEMBL、Drug-Bank、BingDB、PDB、KEGG等數(shù)據(jù)庫中尋找與目標(biāo)化合物3D 構(gòu)型相似的小分子的靶標(biāo)來預(yù)測目標(biāo)化合物的靶標(biāo)，并根據(jù)隨機(jī)游走算法對(duì)目標(biāo)化合物與靶標(biāo)結(jié)合度進(jìn)行排序，通過該算法不僅成功地開發(fā)了老藥新用，而且篩選出了新型冠狀病毒的抗病毒藥物用于臨床治療[12]。

本文首先對(duì)海綿樣品進(jìn)行提取和分離，然后用磺酰羅丹明B（SRB）法對(duì)其分離物進(jìn)行腫瘤細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)，以期得到抗腫瘤活性好的化學(xué)成分或組分，并利用Chemmapper Server 對(duì)所得的化學(xué)成分進(jìn)行靶點(diǎn)計(jì)算，推測可能的作用靶點(diǎn)，為抗腫瘤候選藥物的開發(fā)提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑和原料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Aglient DD2600 MHz 型核磁共振儀（美國Aglient 公司）；Bruker AVANCEⅢ400 MHz型核磁共振儀（瑞士Bruker 公司）；電噴霧-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）；Aglient 1260 型高效液相色 譜 儀（Aglient 公 司） ； 半 制 備 液 相 色 譜 儀（UV230Ⅱ紫外-可見檢測器，P270 高壓恒流泵，大連依利特公司）；色譜柱Xcharge C18（4.6 mm×250 mm×5 μm，華譜新創(chuàng)科技有限公司）；色譜柱C18HCE（10 mm×250 mm×10 μm，華譜新創(chuàng)科技有限公司）；色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm×5 μm，Aglient 公司）；FA2004 型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；柱層析硅膠（煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司）；Sephadex LH-20 型凝膠（Pharmacia 公司）；BB5060 型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；SW-CJ-2FD 型潔凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州富泰空氣技術(shù)有限公司）；SpectraMax M2 型多 功 能 酶 標(biāo) 儀（美 國Molecular Devices 公 司）；LOOYE ZX 98-1 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海魯伊工貿(mào)有限公司）；L-550 型臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司）；LGJ-10D 型冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器有限公司）。

1.1.2 試 劑 DMEM （ Dulbecco's modified eagle medium）高糖培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自HyClone 公司；胎牛血清（FBS）、2.5g/L 胰酶購自Gibco 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，自配，氯化鉀、氯化鈉、十二水合磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀均為分析純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；SRB 購自Sigma-Aldrich 試劑公司；三羥甲基氨易甲烷（Trisbase），分析純，購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 原料 海綿實(shí)驗(yàn)樣品（YT-39）于2011 年8 月采自南海西沙海域，經(jīng)鑒定為Pseudoceratinasp.，樣品保存于海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院海洋藥物研究中心。

1.1.4 細(xì)胞 細(xì)胞株HeLa 人宮頸癌細(xì)胞，A549 人肺癌細(xì)胞，HepG2 人肝癌細(xì)胞，購買自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 提取與分離

稱取海綿樣品（濕重）550 g 粉碎，用甲醇與二氯甲烷（體積比為1∶1）混合溶液超聲提取5 次（400 mL，30 min）。合并提取液，減壓濃縮得到總浸膏24.3 g?？偨嘤?00 mL 甲醇的水溶液（甲醇和水的體積比為1∶1）混懸后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3 次（每次300 mL），乙酸乙酯萃取部位濃縮后得浸膏9.29 g，該浸膏使用硅膠柱色譜分離，依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯（石油醚與乙酸乙酯體積比分別為10∶1, 5∶1, 3∶1, 1∶1, 1∶3, 1∶5）和乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)薄層色譜檢測，合并相同組分，得6 個(gè)組分 (Fr.1 ～ Fr.6)，其中Fr.4 (251 mg)經(jīng)半制備液相分離得到化合物1(15.2 mg)，2(43.2 mg)。

1.3 細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)

采用SRB 法[13]測定體外抗腫瘤增殖活性：取對(duì)數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，胰酶消化后，用含有10% （體積分?jǐn)?shù)）FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，以每毫升2.5 × 104個(gè)、每孔200 μL 均勻地接種于96 孔板中。細(xì)胞在5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 貼壁生長后，棄去原上清培養(yǎng)液，加入200 μL 帶有不同濃度樣品的培養(yǎng)液作為實(shí)驗(yàn)組，以不同質(zhì)量濃度（6.25～100 μg/mL）5-氟尿嘧啶(5-FU)為陽性對(duì)照組，以不加樣品的空白組為對(duì)照組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞在培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 質(zhì)量濃度為100g/L 的三氯乙酸培養(yǎng)液（不含F(xiàn)BS 的DMEM 高糖培養(yǎng)液），置于4 ℃下固定。1 h 后，棄去培養(yǎng)液，用超純水清洗5 次，每孔加入100 μL 質(zhì)量濃度為4g/L 的 SRB 溶液染色。20 min后棄去染色液，用體積分?jǐn)?shù)為1% 冰醋酸溶液洗去多余SRB 溶液。每孔加入150 μL 的10 mmol/L 無緩沖的 Trisbase 溶解SRB，振蕩搖勻后，在540 nm 處測定吸光度值（A），同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（完全培養(yǎng)液）和陽性對(duì)照組（5-FU），則細(xì)胞增殖抑制率（R）計(jì)算公式為：R=（1?ASample/ABlank）×100%，計(jì)算結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用軟件GraphPad Prism 5 進(jìn)行非線性擬合分析，計(jì)算各樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.4 化合物靶點(diǎn)及相互作用預(yù)測

在 數(shù) 據(jù) 庫chemmapper（網(wǎng) 址 http://lilab.ecust.edu.cn/chemmapper/）中上傳化合物1 和2 的分子構(gòu)型，采用SHAFTS 方法預(yù)測與化合物1 和2 的3D 構(gòu)型相似的化合物的作用靶點(diǎn)，選取BingDB 作為篩選數(shù)據(jù)庫，根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)將篩選結(jié)構(gòu)相似度的閾值分別定為1.0、0.8，根據(jù)所得靶點(diǎn)的功能和作用機(jī)制篩選對(duì)細(xì)胞增殖、生長、遷移、DNA 修復(fù)相關(guān)的靶點(diǎn)以及具有相互聯(lián)系的靶點(diǎn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同組分及化合物的腫瘤細(xì)胞毒活性

各組分及化合物對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的IC50的結(jié)果見表1，由表1 可以看出6 個(gè)分離組分中對(duì)腫瘤細(xì)胞A549、HeLa 和HepG2 的細(xì)胞毒活性最佳的組分為Fr.6（IC50值 均 不 大 于 15.28 μg/mL） ， 其 次為Fr.4（IC50值均不大于33.16 μg/mL），兩個(gè)組分的活性均優(yōu)于或與陽性對(duì)照5-FU 相當(dāng)。液相圖上Fr.4 組分只有2 個(gè)峰，顯示基本無其他雜質(zhì)，因此在該組分中分離得到2 個(gè)化合物（圖1），分別鑒定如下：

表1 各組分及化合物對(duì)3 種腫瘤細(xì)胞的IC50 值Table 1 IC50 values of different fractions and compounds against three different tumour cells

圖1 化合物1 和2 的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structures of compounds 1 and 2

化合物1：淡黃色粉末，ESI-MS 顯示有[M+Na]+峰，m/z為694.8，696.8，698.8，700.8，702.8，離子豐度比為1∶4∶6∶4∶1，該化合物有4 個(gè)溴原子。1H-NMR(600 MHz, acetonitrile-d6，δH): 7.41 (2H, s, H-3, H-5),7.17 (1H, s, NH), 6.40 (1H, s, H-13), 4.70 (1H, dd,J=7.1, 4,6 Hz, H-7), 4.14 (1H, s, H-17), 3.71 (3H, s, OMe),3.68 (1H, d,J= 18.9 Hz, H-11), 3.46 (1H, ddd,J= 13.8,6.2, 4.6 Hz, H-8), 3.39 (1H, dt,J= 13.5, 6.6 Hz, H-8),3.04 (1H, d,J= 18.3 Hz, H-11);13C-NMR (150 MHz,acetonitrile-d6，δC): 160.5 (C-9), 155.2 (C-10), 150.3 (C-1), 148.9 (C-15), 138.2 (C-4), 132.3 (C-13), 131.0 (C-3,C-5), 122.2 (C-16), 113.6 (C-14), 110.9 (C-2, C-6), 91.4(C-12), 75.0 (C-17), 71.4 (C-7), 60.6 (OMe), 47.3 (C-8),39.9 (C-11)。與文獻(xiàn)[14-15] 對(duì)照，鑒定化合物1 為hemifistularin-3。

化合物2：黃色粉末，ESI-MS 顯示有 [M+Na]+峰，m/z為1098.7，1100.7，1102.7，1104.7，1106.7，1108.7，1110.7，離子豐度比為1∶6∶15∶20∶15∶6∶1，該化合物有6 個(gè)溴原子。1H-NMR (600 MHz,acetonitrile-d6，δH): 7.46 (2H, s, H-15 和H-17), 7.27(1H, t,J= 6.0 Hz, NH), 7.13 (1H, t,J= 6.2 Hz, NH),6.40 (1H,s, H-5), 6.39 (1H, s, H-5’), 4.14 (1H, s, H-1),4.13 (1H, s, H-1’), 4.04 (2H, t,J= 6.0 Hz, H-12), 3.71(6H, s, 3-OMe and 3’-OMe), 3.65～3.72 (2H, m, H-7 and H-7’), 3.54 (2H, q,J= 6.6 Hz, H-10), 3.46 (2H, q,J=6.7 Hz, H-20), 3.06 (1H, d,J= 18.4 Hz, H-7 or H-7’),3.03 (1H, d,J= 18.4 Hz, H-7 or H-7’), 2.74～2.79 (2H,m, H-19), 2.06 (2H, p,J= 6.5 Hz, H-11);13C-NMR (150 MHz, acetonitrile-d6，δC): 160.1 (C-9 和C-9’), 155.4 (C-8 or C-8’), 155.3 (C-8 or C-8’), 152.2 (C-13), 148.9 (C-3 和C-3’), 139.7(C-16), 134.3 (C-15 和C-17), 132.4(C-5), 132.3 (C-5 ’), 122.1 和 122.0 (C-2 和C- 2 ’),118.5 (C-14 和C-18), 113.6 (C-4 和C-4 ’), 91.8 和91.7(C-6 和C-6’), 75.0 (C-1 和C-1’), 72.3 (C-12),60.6 (3-OMe 和3’-OMe), 40.8 (C-20), 40.0 (C-7 和C-7’), 37.5 (C-10), 34.7 (C-19), 30.3(C-11)。與 文獻(xiàn)[16]對(duì)照，鑒定化合物2 為11,19-dideoxyfistularin 3。

細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)表明來源于組分Fr.4 的化合物1 和2 的活性遠(yuǎn)低于組分的活性（表1），考慮兩者可能存在協(xié)同增效作用。

2.2 化合物1 和化合物2 復(fù)配后的腫瘤細(xì)胞毒活性

化合物1 和化合物2 復(fù)配后對(duì)3 種腫瘤細(xì)胞增殖抑制能力均高于化合物1 和化合物2 單獨(dú)作用的能力（表2），且隨著化合物2 比例的增加，復(fù)配物對(duì)3 種腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性均先增強(qiáng)后減弱，化合物1 和化合物2 以物質(zhì)的量之比1∶2 進(jìn)行配比時(shí)，對(duì)A549 細(xì)胞增殖抑制能力最強(qiáng)，IC50值最低可達(dá)到8.71 μmol/L，說明化合物1 和化合物2 之間存在協(xié)同作用，且與化合物物質(zhì)的量之比存在聯(lián)系。

表2 化合物1 和2 不同配比下對(duì)3 種腫瘤細(xì)胞的IC50 值Table 2 IC50 values of mixed compounds 1 and 2 against different cell lines

表3 化合物1 和2 不同配比的CI 值Table 3 CI values of mixed compounds 1 and 2

2.3 化合物靶標(biāo)及相互作用預(yù)測

化合物1 及化合物2 的結(jié)構(gòu)相似，預(yù)測的靶標(biāo)有相同但排序有所不同。表4 和表5 分別列舉了化合物1 和2 中分?jǐn)?shù)前10 的靶標(biāo)，其中靶標(biāo)Vanilloid Receptor 1 (TRPV1, VR1)（Homo sapiens）和Hsf1 protein（Mus musculus）排名均在前三。Vanilloid Receptor 1(TRPV1,VR1)?辣椒素受體1，主要是與抗炎、鎮(zhèn)痛、神經(jīng)[18]相關(guān)的作用，在被激活時(shí)具有抑制腫瘤增殖的作用[19]；Hsf1 protein 是熱休克轉(zhuǎn)錄因子(heat shock factors, HSFs)中最主要的一種，由于其在轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)，因而不僅可作為癌癥診斷預(yù)后指標(biāo)，還可以直接作為腫瘤治療靶點(diǎn)[20]?；诙喟袠?biāo)的兩種化合物聯(lián)合使用，可能是其顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。

表4 化合物1 預(yù)測靶標(biāo)Table 4 Predicted targets of compound 1

表5 化合物2 預(yù)測靶標(biāo)Table 5 Predicted targets of compound 2

3 討 論

我國南海海域海綿資源豐富且氣候地理?xiàng)l件獨(dú)特，海綿次級(jí)代謝產(chǎn)物的多樣性很大程度上源于其生長環(huán)境的影響[21]，對(duì)我國南海海域的海綿Pseudoceratinasp.次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行抗腫瘤成分研究，發(fā)現(xiàn)了潛在的生物醫(yī)藥活性物質(zhì)。在樣品分離過程中，得到的化合物1 和2 對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制活性遠(yuǎn)低于其上一級(jí)組分Fr.4，但是兩者對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞生長具有協(xié)同增效作用。藥物的協(xié)同作用受到醫(yī)藥工作者的廣泛關(guān)注，特別在化療藥的減毒增效[22]和抗耐藥性[23]方面的研究較多，但作用機(jī)理尚不清晰，而對(duì)同一來源的化合物間配伍的協(xié)同增效作用則研究更少。

許多生物活性成分會(huì)比其相應(yīng)的萃取物活性弱，原因可能是分離過程中高活性物質(zhì)的丟失，本研究中從組分Fr.4 分離出化合物1 和2，排除了高活性物質(zhì)丟失的可能，抗腫瘤活性增強(qiáng)的原因?yàn)閰f(xié)同作用機(jī)制所致。

協(xié)同增效的作用可能是共存成分對(duì)活性成分的助溶、助轉(zhuǎn)運(yùn)等作用從而提高活性成分的效用[17]，然而本研究中化合物1 和2 的抗腫瘤活性均不高，兩者之間沒有一個(gè)核心的高活性成分，由此排除由于化合物的增溶引起的增效作用。

在化合物1 和2 的靶標(biāo)預(yù)測中，根據(jù)靶標(biāo)的功能篩選出與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的靶點(diǎn)，比較突出的第一個(gè)為Vanilloid Receptor 1，表示化合物可能作為Vanilloid Receptor 1 激動(dòng)劑激活辣椒素受體而具有抗腫瘤作用。Vanilloid Receptor 1 在HeLa細(xì)胞中高表達(dá)[24]，且在A549 細(xì)胞中比HepG2 細(xì)胞表達(dá)多[25]，從表2 中可以看出化合物1 和2 聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)HepG2 細(xì)胞株的細(xì)胞毒相對(duì)最??；第二個(gè)為Hsf1蛋白質(zhì)，表明化合物1 和2 可作為Hsf1 抑制劑，通過抑制Hsf1 使得變性蛋白增多誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究表明，Hsf1 抑制劑也可以與其他藥物聯(lián)用以增加藥物對(duì)癌細(xì)胞的殺傷性[20]，這與本研究中兩個(gè)化合物協(xié)同增效作用結(jié)果相一致。Hsf1 在惡性腫瘤中基本都是高表達(dá)，HepG2[26]、A549[27]、HeLa[28]細(xì)胞株經(jīng)常被用于研究與Hsf1 有關(guān)的工作，因此兩化合物聯(lián)合增效作用在3 種細(xì)胞株中均有表現(xiàn)。

本文研究了化合物1 和2 的協(xié)同作用機(jī)制和預(yù)測的靶標(biāo)。未來的工作將通過靶點(diǎn)Hsf1 等驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)來研究和探索抗腫瘤增效作用機(jī)制。本文為海綿提取物的分離、活性研究和應(yīng)用模式提供新的思路，從而實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)地在海洋資源中發(fā)現(xiàn)和開發(fā)候選藥物。