吳蘇君，李 希，王 曦

(山西農業(yè)大學動物科學學院，山西 太原 030032)

細胞體外增殖技術被稱為細胞培養(yǎng)，廣泛應用于科研、教學、臨床試驗、制備生物制品等領域，其中污染控制是關鍵。能導致細胞污染的微生物很多，最為常見的是支原體[1]。由于缺乏細胞壁的支撐，支原體可變形通過0.22 μm濾膜，常用抗生素如青霉素和鏈霉素對其去除效果不佳[2]。世界范圍內使用中的細胞系支原體污染發(fā)生率為30%～60%[3-5]，國內來源的細胞株系支原體污染發(fā)生率高達60%[6]。支原體污染初期，細胞形態(tài)變化不甚明顯，支原體滴度隨時間延長逐漸升高，最高可達109個/mL。污染發(fā)生后期，支原體改變細胞DNA/RNA及蛋白的表達，導致其變形、死亡[7]。因此，在污染初期盡快進行支原體檢測、去除尤為重要。目前檢測及去除支原體污染的方法很多。呂梁黑山羊作為山西省地方優(yōu)良品種，具有珍貴的生物種用價值[8]。本試驗采取呂梁黑山羊耳緣組織培養(yǎng)成纖維細胞，結合運用高倍顯微鏡直接觀察法和DNA熒光染色法，快速發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)過程中的支原體污染，利用支原體抗生素Plasmocin將其去除，檢測去除效果，進而構建穩(wěn)定的細胞培養(yǎng)體系，為后續(xù)探究呂梁黑山羊種質資源的利用提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 呂梁黑山羊(0～3月齡)耳緣組織，采自山西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所克隆基地試驗羊場；胎牛血清FBS，購自Hyclone公司；DMEM，購自Gibco公司；DPBS、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、Hoechst 33342，均購自Sigma公司；PlasmocinTMtreatment，購自InvivoGen公司；細胞cDNA提取試劑盒、DL2 000 DNA Marker，均購自TIANGEN公司；RT-PCR試劑盒，購自TaKaRa公司；其他試劑均為國產分析純。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 呂梁黑山羊耳緣成纖維細胞的原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、凍存和復蘇 選擇0～3月齡的呂梁黑山羊，獲取耳尖皮膚組織(1 cm2)進行原代培養(yǎng)。每隔2 d更換培養(yǎng)液，5～7 d后觀察組織塊周圍有無細胞遷出，待原代培養(yǎng)的單層細胞匯合度達到80%時，進行傳代培養(yǎng)或冷凍保存。細胞復蘇時，觀察細胞活力狀態(tài)。

1.2.2 支原體污染檢測 高倍顯微鏡直接觀察：疑為支原體污染的細胞及對照組細胞在高倍顯微鏡下直接觀察，根據(jù)其形態(tài)學變化，對比判斷有無污染。DNA熒光染色法：疑為支原體污染的待測細胞及對照組細胞在室溫下加入濃度為5 μg/mL的Hoechst 33342染色30 min，DPBS洗滌3次，熒光顯微鏡紫外光下觀察，判斷有無支原體污染。

1.2.3 支原體污染去除 疑為支原體污染的待測細胞更換添加25 μg/mL Plasmocin的細胞培養(yǎng)液，正常傳代培養(yǎng)，連續(xù)藥物處理14 d。

1.2.4 藥物處理后支原體污染檢測 用高倍顯微鏡直接觀察法和DNA熒光染色法分別對比藥物處理試驗組、對照組，方法同上。PCR法檢測：根據(jù)16S rRNA支原體種屬特異性區(qū)域設計引物(上游引物：5′-CACAATGGGCGAAAGCCTGAT-3′；下游引物：5′-CATCGTTTACGGCGTGGACTACC-3′)，產物長度為453 bp。使用cDNA提取試劑盒提取藥物處理試驗組、對照組細胞的基因組cDNA。以其為模板進行RT-PCR反應，反應體系(總體積20 μL)：上下游引物各0.8 μL、ExTap酶10 μL、模板2 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL，加ddH2O 6 μL。反應條件：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳并觀察。

1.2.5 細胞生長曲線的測定 Plasmocin連續(xù)處理14 d的試驗組細胞匯合度達到80%時，消化重懸細胞，以1×104個/孔接種至24孔板中培養(yǎng)。每24 h計數(shù)細胞，每次計數(shù)重復3次，求平均值，連續(xù)計數(shù)7 d后，根據(jù)時間和細胞密度繪制細胞生長曲線。

2 結果

2.1 細胞原代、傳代培養(yǎng)及凍存、復蘇培養(yǎng) 通過組織塊貼壁培養(yǎng)法成功分離出呂梁黑山羊耳緣組織成纖維細胞。培養(yǎng)10 d左右能分辨出組織塊周圍有梭形且邊緣立體的成纖維細胞。形態(tài)學觀察可見細胞主要呈梭形、多角形或不規(guī)則形，細胞排列分散，見封三彩版圖1A；細胞傳代后生長狀態(tài)良好，形態(tài)正常，見封三彩版圖1B；細胞復蘇后活力達到80%，生長狀態(tài)良好，形態(tài)正常，見封三彩版圖1C。

圖1 呂梁黑山羊成纖維細胞培養(yǎng)Fig.1 Lyuliang black goat fibroblast cultureA：細胞原代培養(yǎng)(40×)；B：細胞傳代培養(yǎng)(200×)；C：細胞復蘇培養(yǎng)(200×)A:Cell primary culture(40×)；B:Cell passage culture(200×)；C:Cell resuscitation culture(200×)

2.2 高倍顯微鏡直接觀察 疑為支原體污染的待測細胞折光性差，扁平分散，培養(yǎng)皿底部有黑點，見圖2A；對照組細胞大多呈梭形，邊緣立體，培養(yǎng)皿底部未見明顯黑點，見圖2B。但肉眼觀察比較細胞形態(tài)學變化并不顯著。

圖2 顯微鏡下觀察呂梁黑山羊成纖維細胞(200×)Fig.2 Observe the Lyuliang black goat fibroblast under the microscope(200×)A：疑被支原體污染的細胞；B：對照組A:Suspicious Mycoplasma contaminated cells；B:Control group

2.3 DNA熒光染色法 疑為支原體污染的待測細胞在細胞核外可見散在熒光，推測被支原體污染，見封三彩版圖3A；對照組細胞核區(qū)可見邊緣整齊清晰的熒光，核外無熒光，見封三彩版圖3B。

圖3 熒光顯微鏡下觀察呂梁黑山羊成纖維細胞(200×)Fig.3 Observe the Lyuliang black goat fibroblast under the microscope(200×)A：疑被支原體污染的細胞，核外有散在熒光(箭頭)；B：對照組A:Suspicious Mycoplasma contaminated cells，had scattered fluorescence outside the nucleus(Arrow)；B:Control group

2.4 支原體污染藥物處理后檢測 使用Plasmocin藥物連續(xù)處理14 d后，高倍顯微鏡下肉眼觀察細胞形態(tài)恢復立體，生長均勻，培養(yǎng)皿底部黑點明顯減少，見封三彩版圖4A；對照組見封三彩版圖4B。熒光試劑Hoechst 33342染色觀察DNA，藥物處理試驗組和對照組細胞均只見胞核，核外未見散在熒光，見封三彩版圖4C、4D。PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，藥物處理試驗組和對照組細胞條帶均呈陰性，見封三彩版圖4E。

圖4 藥物處理呂梁黑山羊成纖維細胞后支原體檢測結果Fig.4 Detection results of Mycoplasma after drug treatment with the Lyuliang black goat fibroblasA：顯微鏡下觀察藥物處理組細胞(200×)；B：顯微鏡下觀察對照組細胞(200×)；C：熒光顯微鏡下觀察藥物處理組細胞(200×)；D：熒光顯微鏡下觀察對照組細胞(200×)；E：支原體PCR檢測(M：DL2 000相對分子質量標準；1：藥物處理試驗組；2：對照組)A:Observe the drug treatment experimental group under the microscope(200×)；B:Observe the control group under the microscope(200×)；C:Observe the drug treatment experimental group under the fluorescence microscope(200×)；D:Observe the control group under the fluorescence microscope(200×)；E:PCR detection of Mycoplasma(M:DL2 000 marker；1:Drug treatment experimental group；2:Control group)

2.5 細胞生長曲線的繪制 用Plasmocin處理細胞14 d，根據(jù)細胞計數(shù)結果，以單位細胞密度為縱坐標、培養(yǎng)時間為橫坐標繪制生長曲線。結果如圖5所示，細胞生長曲線呈S型分布，1～3 d細胞處于適應期，生長緩慢；3～6 d細胞處于指數(shù)生長期，生長旺盛；6～7 d細胞處于平臺期。

圖5 呂梁黑山羊成纖維細胞生長曲線Fig.5 The growth curve of the Lyuliang black goat fibroblast

3 討論

支原體污染在細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生率很高，細胞被支原體污染后，其功能及代謝均受到影響。支原體可以吸附到細胞表面，破壞細胞膜的完整性，影響細胞信號傳遞；還可以進入宿主細胞內，消耗細胞中的營養(yǎng)物質，造成細胞生長緩慢甚至停止；使pH降低，影響細胞代謝；引起細胞染色體畸變或數(shù)量變化[9-14]。此外，支原體代謝產物還能誘導宿主細胞發(fā)生免疫抑制和免疫損傷[15]、引起胞膜相變運動等[16-17]。值得注意的是，支原體在與宿主細胞的長期共存中形成了可逃避自噬的胞內生存機制[18]，支原體的滴度將隨著污染時間的延長而逐漸升高[19]。因此，在支原體污染早期就對支原體進行去除對保護細胞尤為重要。

目前，檢測細胞培養(yǎng)液中支原體的方法有很多種，如顯微鏡觀察法、DNA熒光染色法、電鏡、ELISA法、支原體直接培養(yǎng)法、聚合酶鏈反應(PCR)及熒光定量PCR等[20-23]，但均存在一些缺點。現(xiàn)從試驗周期、優(yōu)缺點、價格、適用范圍等方面將常用的4種支原體污染檢測方法的進行比較[20]，見表1。

表1 4種常用支原體污染檢測方法比較Table 1 Comparison of four common detection methods of Mycoplasma contamination

高倍顯微鏡直接觀察法：支原體污染早期，細胞生長變慢，立體性差，細胞形態(tài)變化不甚顯著，細胞間有微小黑點，需在高倍顯微鏡下仔細觀察；隨著污染時間延長，顯微鏡下可觀察到細胞生長分散，大部分細胞開始出現(xiàn)空泡，呈現(xiàn)“流沙狀”脫落、崩解[14]，培養(yǎng)皿底部有明顯黑點[20]，該方法在懷疑污染時具有一定鑒別作用。有研究指出，支原體污染早期細胞形態(tài)變化不顯著，該方法假陽性和假陰性率較高。本試驗發(fā)現(xiàn)，在懷疑污染發(fā)生的情況下篩查細胞，能觀察到細胞形態(tài)變化及細胞間的黑點。但該方法不能作為常規(guī)檢測方法，只能作為鑒別方法。DNA熒光染色法：熒光染料Hoechst 33342能選擇性結合DNA小溝，支原體DNA和細胞DNA均會被染色[1]。利用該方法能在熒光顯微鏡下直接觀察到支原體，即支原體除胞核有熒光外，核外還可看到許多分散的熒光小點[11]。但細胞碎片染色后容易出現(xiàn)假陽性，或支原體污染非常輕微時容易出現(xiàn)假陰性，一般需要無支原體污染的細胞作為對照[13]。PCR檢測方法可快速檢測細胞培養(yǎng)物和生物制品、血清等生物材料中的支原體污染[22]，具有較高的靈敏度，特異性較強；但由于支原體的多樣性，有種、屬間交叉反應[18]，支原體與衣原體具有同源性[24]，檢測結果可能出現(xiàn)假陽性，所以在選擇靶序列及引物方面必需謹慎。上述方法各有特點，僅用單一方法檢測存在局限性。鑒于高倍顯微鏡為細胞試驗中必備儀器，Hoechst 33342為常備試劑，所以在細胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液在更換后短時間內顏色變化(顏色呈橙色或黃色)，初步懷疑為支原體污染時，可使用高倍顯微鏡直接觀察法和DNA熒光染色法結合檢測，能在1 h內發(fā)現(xiàn)支原體污染，據(jù)此快速進行支原體污染去除，將污染控制在數(shù)量及影響較少的早期，對細胞損傷較小，適合于珍貴的細胞。

細胞被支原體污染后，徹底清除非常困難。若污染細胞具有可替代性，應丟棄；若污染細胞來源有限、難以替代，就需要采取措施去除支原體。常見去除方法有克隆法、裸鼠過繼法、加熱法和藥物處理法等[19]，實驗室多采用支原體抗生素Plasmocin去除支原體污染[25]。支原體抗生素Plasmocin能在不影響細胞代謝的提前下可阻止復制叉形成，阻斷DNA復制；干預核糖體的翻譯，阻止蛋白合成，是目前最理想的去除支原體藥物[18-19]，但其價格昂貴，限制了它的廣泛應用[26]。需要注意的是，細胞培養(yǎng)作為無菌技術，過程中不可濫用抗生素，應僅在污染發(fā)生時短期使用，防止微生物混亂。應加強預防和常規(guī)檢測力度，這與有些研究中提到使用低劑量抗生素預防支原體污染的理念不同。

本試驗的不足之處是采用了準確率較低的2種檢測方法來檢測支原體污染，存在假陽性的可能。原因在于首次發(fā)現(xiàn)細胞疑似遭受支原體污染時，需盡快確定是否為支原體污染，并根據(jù)檢測結果使用支原體抗生素Plasmocin對細胞進行處理，以減少支原體對細胞的傷害。為了提高檢測結果的準確性，在Plasmocin處理期后，引入PCR法。綜合使用3種 方法對清除效果進行檢測，發(fā)現(xiàn)經Plasmocin處理后，細胞中支原體已被完全去除。邢龍彬等、張丹丹等研究發(fā)現(xiàn)，不同細胞對Plasmocin的敏感度和耐受性不同，細胞中支原體在被去除后很容易重復感染，需要繼續(xù)給藥[19,25]。本試驗在細胞用Plasmocin處理14 d后，繪制細胞生長曲線，發(fā)現(xiàn)細胞的生長和增殖速度均恢復正常，未復污染。說明呂梁黑山羊成纖維細胞僅需支原體抗生素Plasmocin處理14 d 即可去除支原體早期污染，未復感，不需另外給藥。推測在發(fā)現(xiàn)污染早期對支原體進行去除可能效果更好，不易復感。本試驗在細胞被支原體污染早期快速發(fā)現(xiàn)并及時對其進行處理，建立了細胞污染處理快速反應機制，在細胞培養(yǎng)實際工作中具有很高操作性，實用性強，具有借鑒價值。

預防重于治理，在細胞培養(yǎng)過程中，要時刻警惕支原體及其他污染，制定嚴格規(guī)范的細胞培養(yǎng)間日常管理消毒制度，定期對細胞、試劑、耗材、儀器進行污染檢測，規(guī)范試驗操作和紀錄流程，把污染的可能性降到最低，提高試驗結果的穩(wěn)定性和可靠性。