范志宇，陳萌萌，仇汝龍，胡 波，魏后軍，宋艷華，朱偉峰，徐為中，薛家賓，王 芳

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

2018年，安徽某兔場不間斷發(fā)現(xiàn)死亡毛兔口腔中有增生物、個(gè)體消瘦、顏面變形等情況。本試驗(yàn)對(duì)臨床患病兔進(jìn)行剖檢，通過病理組織石蠟切片方法，對(duì)兔口腔增生物進(jìn)行病理學(xué)檢查，并進(jìn)行了乳頭瘤病毒的檢測。綜合剖檢、病理切片和病原檢測結(jié)果，最終診斷病兔患口腔鱗狀細(xì)胞癌。本試驗(yàn)首次報(bào)道了家兔口腔鱗狀細(xì)胞癌，為相關(guān)疾病的診斷和研究提供了科學(xué)依據(jù)。

1 疾病調(diào)查

通過問詢家兔養(yǎng)殖場場主及養(yǎng)殖人員得知，在本養(yǎng)殖場及周邊5個(gè)兔養(yǎng)殖場均出現(xiàn)口腔腫瘤發(fā)病情況，發(fā)病兔均為毛兔，暫未發(fā)現(xiàn)有肉兔和獺兔發(fā)生該病，并且該病集中發(fā)生于兔毛長且有卷曲的毛兔，發(fā)病率在20%以上，相同養(yǎng)毛期內(nèi)兔毛短而直的毛兔未見發(fā)病?；疾∶媚挲g偏大，均為2歲以上。

2 臨床癥狀

通過問詢得知，當(dāng)發(fā)現(xiàn)毛兔出現(xiàn)口腔問題時(shí)，腫瘤已經(jīng)相對(duì)較大，患病兔出現(xiàn)面部變形，精神沉郁，體溫正常，口腔增生物嚴(yán)重影響動(dòng)物正常采食，采食量減少，吞咽困難，流涎，食欲減退，體重減輕，逐漸消瘦衰竭死亡。

3 大體剖檢病變

對(duì)瀕死的患兔安樂死后剖檢，結(jié)果顯示，患兔發(fā)育完全，體形偏瘦；天然孔(口、鼻、肛門)黏膜呈粉紅色，毛細(xì)血管充盈時(shí)間正常；口腔增生物呈浸潤性生長致使面部腫脹、變形，口腔內(nèi)部皮膚多有壞死與出血；觸診增生物質(zhì)地較硬，有結(jié)締組織將其分為多葉，最大的大小為2.5 cm×2 cm×1 cm，切面灰白色。經(jīng)仔細(xì)檢查，頭部及身體其他部位未發(fā)現(xiàn)增生物。

4 病原檢測

設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增不同的乳頭瘤病毒DNA片段，E3-F:5′-ATGATAGGCAGAACTCCTAAG-3′和E3-R：5′-CAGTTACAACACTCCGGGCAC-3′，擴(kuò)增病毒基因片段E3，大小為 285 bp；E4-F:5′-ATGAGCCATGGACATTGC-3′和E4-R：5′-TTATAAGCTCGCGAAG-CC-3′，擴(kuò)增病毒基因片段E4，大小為639 bp；E5-F：5′-ATGGGCTTTAGTGACGTGTA-3′和E5-R：5′-CTA-GTCGACCCCCAGAACC-3′，擴(kuò)增病毒基因片段E5，大小為639 bp；P-450-F:5′-CTGGCAGAGCGCTTTG-GACCG-3′和450-R:5′-CTTGTCCTTAAACTCCCGCAAAG-3′，擴(kuò)增兔細(xì)胞色素P-450，大小為159 bp，作為有效擴(kuò)增的對(duì)照。反應(yīng)體系：10×PCR Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL，上下游引物各(10 μmol/L)1 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，抽提物5 μL，加水補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min，然后進(jìn)行32次循環(huán)(94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s)，72 ℃ 5 min，4 ℃保溫。

提取增生組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板，利用針對(duì)乳頭瘤病毒的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果為陰性(圖1)，結(jié)合臨床初步判斷該病不是乳頭瘤病毒感染所致。

圖1 PCR擴(kuò)增乳頭瘤病毒不同DNA片段M：DNA marker(DL 2 000)；1～4:以增生物活檢DNA 為模板分別擴(kuò)增病毒核酸E3、E4、E5和兔細(xì)胞色素P450；5～8：以乳頭瘤病毒DNA為模板分別擴(kuò)增病毒E3、E4、E5和兔細(xì)胞色素P450

5 病理切片觀察

對(duì)患病家兔耳緣靜脈注射空氣安樂死后，在兔口腔患部進(jìn)行手術(shù)去除增生物，觀察其形態(tài)，并取增生物進(jìn)行常規(guī)病理組織學(xué)制片，石蠟包埋,切片厚 5 μm，H.E.染色，采集數(shù)碼圖像。結(jié)果顯示，該增生物為鱗狀細(xì)胞癌，癌組織浸潤性生長，形成大小不等，形狀不同的癌細(xì)胞團(tuán)塊，即癌巢，較大的癌巢中心部分發(fā)生角化，即癌珠；腫瘤細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯異型性，即瘤細(xì)胞排列紊亂，瘤細(xì)胞及其核呈多形性。病變中可見少量明顯的角化不全性角質(zhì)囊腫(中插彩版圖2A黃色箭頭)；也可見未非角化型鱗狀細(xì)胞癌小葉，周圍上皮細(xì)胞呈柵欄狀排列(中插彩版圖2B黑色箭頭)，中央呈透明細(xì)胞表現(xiàn)(中插彩版圖2B紅色箭頭)；可見嗜堿性核內(nèi)包涵體。

圖2 兔口腔腫瘤H.E.染色切片觀察 (200 ×)A：角化型鱗狀細(xì)胞癌小葉；黃色箭頭：癌巢中可見少量角質(zhì)化不全性角質(zhì)囊腫；B：非角化型鱗狀細(xì)胞癌小葉；黑色箭頭：周圍上皮細(xì)胞呈柵欄狀排列；紅色箭頭：癌小葉中央呈透明細(xì)胞表現(xiàn)

6 討論

口腔腫瘤即為口腔頜面部腫瘤，有惡性和良性之分[1]。最常見的口腔惡性腫瘤為鱗狀上皮細(xì)胞癌，占口腔惡性腫瘤的90%，其作為全身惡性腫瘤中常見的腫瘤類型，不僅會(huì)造成面部畸形，同時(shí)也由于腫瘤位置的血液循環(huán)以及淋巴回流豐富，因此具有較高的轉(zhuǎn)移率[2-3]。在犬貓臨床中口腔腫瘤發(fā)生的概率較高，占所有腫瘤的6%[4-6]。

隨著家兔養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展，一些品種的家兔(如：曾祖代或祖代種兔、毛兔、寵物兔等)飼養(yǎng)時(shí)間也逐步延長，可能發(fā)生與其他動(dòng)物類似的腫瘤疾病的概率相對(duì)增加。研究顯示，家兔腫瘤疾病發(fā)病率為0.5%～2.7%，常見的家兔腫瘤包括子宮腺癌、乳腺腫瘤和皮膚瘤等[7]，口腔腫瘤也有被報(bào)道，但發(fā)病率似乎較低，多為病毒感染引起的良性腫瘤[1,8-9]，國內(nèi)外尚未見關(guān)于兔惡性口腔腫瘤-鱗狀細(xì)胞癌的報(bào)道[7,10-12]。家兔腫瘤的發(fā)病率受年齡因素的影響很大，由于絕大多數(shù)商品兔和實(shí)驗(yàn)兔都是在2歲以前就被利用，處于老年期的家兔才是腫瘤的易發(fā)年齡，所以一般兔場很少見家兔腫瘤的發(fā)生。在實(shí)際生產(chǎn)中，毛兔養(yǎng)殖時(shí)間通常在2年以上，由于毛兔養(yǎng)殖時(shí)間周期長，發(fā)生腫瘤的概率也大大增加。

本試驗(yàn)首次報(bào)道了兔口腔鱗狀細(xì)胞癌。本試驗(yàn)結(jié)果提高了人們對(duì)動(dòng)物腫瘤病，特別是兔口腔惡性腫瘤的認(rèn)識(shí)，為未來相關(guān)疾病的診斷和研究提供了科學(xué)依據(jù)。然而，本病產(chǎn)生的具體原因不明，推測可能與飲食、微生物、遺傳因素及品種等因素有關(guān)[13-14]。在調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖戶在選育過程中更偏愛卷毛的兔子，選育的卷毛兔更容易得口腔惡性腫瘤，這可能與卷毛兔自身存在基因缺陷有關(guān)。在江蘇鹽城等地調(diào)研中也發(fā)現(xiàn)類似病例，均為毛兔發(fā)病，在養(yǎng)毛期相同的情況下，易發(fā)病兔的被毛比正常毛兔被毛長，且前端易卷曲，也進(jìn)一步證實(shí)了該病的發(fā)生和遺傳因素可能有較大關(guān)聯(lián)。

目前，口腔腫瘤的臨床治療中通常采取包括手術(shù)、化學(xué)藥物、放射、加熱治療以及營養(yǎng)治療等具有針對(duì)性的治療方式，并在綜合治療原則的基礎(chǔ)上，將各個(gè)治療方法進(jìn)行有效的聯(lián)合[2]。由于鱗狀細(xì)胞癌的具體病因還不清楚，暫時(shí)還沒有行之有效的預(yù)防手段，在本試驗(yàn)中，考慮到經(jīng)濟(jì)效益的因素，為了預(yù)防腫瘤的發(fā)生以及減小腫瘤疾病對(duì)家兔的影響，建議養(yǎng)殖場加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，在選育過程中，選擇沒有腫瘤的母兔進(jìn)行繁殖，如遇到有腫瘤的母兔應(yīng)及時(shí)停止繁育并淘汰。對(duì)于寵物兔而言，由于大部分品種有毛兔的遺傳背景，且飼養(yǎng)時(shí)間相對(duì)較長，參考犬、貓等寵物的相關(guān)報(bào)道[4,15]，建議在沒有轉(zhuǎn)移病灶的情況下，第一時(shí)間手術(shù)切除全部腫瘤，這樣對(duì)治愈該病可起到積極作用，也可在確診后進(jìn)行安樂死。