江 濤， 韋雪亮△， 肖書奇

(1. 廣西大學(xué)體育學(xué)院， 南寧 530004； 2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

谷氨酰胺是合成蛋白質(zhì)的22種氨基酸之一，在人和動物的血液中含量非常豐富，谷氨酰胺參與嘧啶堿、嘌呤堿、氨基糖等物質(zhì)的合成，還可以作為一些分裂快速細(xì)胞的能源物質(zhì)[1]。谷氨酰胺可轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼幔修D(zhuǎn)氨和提供氮源的作用[2]。大量運(yùn)動后肌肉中乳酸、肌酸激酶、乳酸脫氫酶等增多，使骨骼肌酸痛，同時還導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)源性氧自由基產(chǎn)生增多，運(yùn)動員產(chǎn)生疲勞感，影響運(yùn)動員的體力恢復(fù)和運(yùn)動能力，最終影響運(yùn)動成績[3]。因此，提高運(yùn)動員機(jī)體的抗氧化能力，盡快解除疲勞狀態(tài)，提高其運(yùn)動能力是一項需要解決的問題[4]。目前，谷氨酰胺在改善運(yùn)動性疲勞方面的作用已經(jīng)被部分研究報道[5]，但其改善運(yùn)動性疲勞的機(jī)制仍不清楚，且相關(guān)報道較少，明確谷氨酰胺改善運(yùn)動性疲勞的效果及機(jī)制對體力恢復(fù)、解除疲勞和挺高運(yùn)動能力具有重要意義。本研究采用谷氨酰胺對大鼠進(jìn)行干預(yù)，旨在探究谷氨酰胺抗運(yùn)動疲勞、骨骼肌氧化以及肝臟細(xì)胞凋亡的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

8周齡SPF級雄性SD大鼠20只，體重180～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。各組大鼠自由進(jìn)食和飲水，鼠房環(huán)境保持溫度22～25℃ ，相對濕度35%～40%，12 h光照/黑暗交替。

1.2 主要試劑

谷氨酰胺購自Invitrogen公司；ELISA檢測試劑盒購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；電化學(xué)發(fā)光試劑盒購自天根生化科技有限公司；熒光實(shí)時定量PCR檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Bcl-2和Bax引物委托寶生物(大連)工程有限公司合成。

1.3 模型建立與分組

適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后，將大鼠隨機(jī)分為對照組和谷氨酰胺干預(yù)組，每組10只。谷氨酰胺干預(yù)組大鼠采用每天1 g/kg谷氨酰胺灌胃約2 ml,溶劑為生理鹽水，對照組大鼠以同體積生理鹽水灌胃，持續(xù)7 d。

1.4 力竭試驗

將大鼠投入200 cm×100 cm×100 cm游泳池中游泳，水深為80 cm，水溫為(25±2)℃，使大鼠游泳直到力竭，即大鼠沉入水下10 s以上不能上浮，且不能進(jìn)行翻正反射。

1.5 樣品采集

力竭試驗結(jié)束后，禁食不禁水12 h，處死大鼠，腹主動脈取血5 ml 經(jīng)3 000 r/min離心15 min，分離血清，-20℃冰箱凍存，用于谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、乳酸(lactic acid,LD)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平檢測。迅速分離股四頭肌，4℃預(yù)冷的生理鹽水沖洗，濾紙拭干。以預(yù)冷的生理鹽水作為勻漿介質(zhì)，制成100 g/L肌肉組織勻漿，用于GSH、SOD和MDA檢測。

1.6 抗氧化指標(biāo)檢測

采用ELISA檢測血清及肌肉組織中GSH和MDA水平及SOD活力，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.7 血清乳酸水平檢測

采用ELISA檢測血清中乳酸(LD)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.8 血清肌酸激酶及乳酸脫氫酶活力檢測

采用肌酸激酶(CK)及乳酸脫氫酶(LDH)活力檢測試劑盒測定血清中CK及LDH活力，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.9 肝組織Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)水平檢測

采用熒光實(shí)時定量PCR 檢測肝組織中Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)水平。常規(guī)提取肝組織總RNA，以GAPDH為內(nèi)參照，按照試劑盒說明書進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物根據(jù)NCBI中的基因序列，通過Primer 5軟件進(jìn)行設(shè)計，的所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列：GAPDH上游：5’-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3’，下游：5’-TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3’；Bcl-2 上游引物為5’-CAAGAATGAAAGCACATCC-3’，下游引物為5’-ATCCCAGCCTCCGTTATCC-3’；Bax上游引物為5’-GGCTGGCAAGGCCTGGT-3’，下游引物為5’-AGCCACAAAGATGGTCACTGTCT-3’。反應(yīng)體系為25 μl,包括2.5×RealMasterMix/20×SYBR 溶液12 μl，上下游引物各1.0 μl，模板2 μl，無酶水9 μl。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，每個樣品均設(shè)3個平行重復(fù)。采用2-△△Ct方法計算目標(biāo)基因表達(dá)相對水平。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 谷氨酰胺對大鼠力竭時間和力竭運(yùn)動后血清CK、LDH活性及LH水平影響

如表1所示，谷氨酰胺干預(yù)組大鼠的力竭時間顯著大于對照組(P<0.05)。谷氨酰胺干預(yù)組大鼠血清中的CK、LDH活性及LD水平均顯著低于對照組(P<0.05)，表明補(bǔ)充谷氨酰胺可以降低大鼠組織細(xì)胞損傷，減少乳酸在血液中的堆積，減緩大鼠運(yùn)動性疲勞。

Tab. 1 Effects of glutamine on rats’exhaustive time and serum CK, LDH activity and LH level after exhaustive n=10)

2.2 谷氨酰胺對大鼠力竭運(yùn)動后血清、股四頭肌勻漿中GSH水平的影響

如表2所示，谷氨酰胺組大鼠力竭后，其血清及骨骼肌中GSH水平均顯著高于對照組(P<0.05)，說明補(bǔ)充谷氨酰胺后，大鼠體內(nèi)谷氨酸含量也隨之升高，使得合成的GSH水平也升高。

Tab. 2 Effects of Glutamine on rats’GSH levels in serum and quadriceps femoris homogenate after exhaustive n=10)

2.3 谷氨酰胺對大鼠力竭運(yùn)動后血清、股四頭肌勻漿中SOD水平、血清、股四頭肌勻漿中MDA水平的影響

如表3所示，谷氨酰胺組大鼠力竭后，其血清及骨骼肌中SOD水平均顯著高于對照組(P<0.05)，可能由于GSH的還原型將被自由基氧化的SOD還原，導(dǎo)致體內(nèi)SOD水平出現(xiàn)升高。谷氨酰胺組大鼠力竭后，其血清及骨骼肌中MDA水平均顯著低于對照組(P<0.05)。

Tab. 3 Effects of glutamine on rats’SOD levels in serum, quadriceps homogenate and MDA level in serum and quadriceps n=10)

2.4 谷氨酰胺對大鼠肝組織中Bcl-2 mRNA、Bax mRNA水平影響

如表4所示，谷氨酰胺干預(yù)組大鼠抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)，而促凋亡基因Bax mRNA明顯低于對照組(P< 0.05)。

Tab. 4 Effects of glutamine on rats’mRNA expression levels of Bcl-2 and Bax in livers n=10)

3 討論

肌酸激酶也稱為肌酸磷酸激酶，在骨骼肌和平滑肌中的含量較多，主要存在于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮和ATP再生有直接關(guān)系[6]。乳酸脫氫酶幾乎存在于所有組織中，以骨骼肌中含量最豐富，有五種同工酶。有研究表明，機(jī)體進(jìn)行大量運(yùn)動時，血清和骨骼肌中的CK、LDH和LD的含量都會增加[7]?？赡苁怯捎跈C(jī)體大量運(yùn)動時，組織器官的自由基增多，細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層發(fā)生過氧化反應(yīng)，損害了細(xì)胞膜的完整性，使得細(xì)胞膜對CK和LDH的阻擋作用減弱，CK、LDH和LD從細(xì)胞膜內(nèi)流向膜外，導(dǎo)致血清中的含量升高[8]。機(jī)體進(jìn)行大量運(yùn)動時，由于機(jī)體供氧相對不足，會使得三羧酸循環(huán)釋放的能量不足以供肌體需求量，因此，無氧呼吸作用加快，產(chǎn)生大量的LD，致使血液中LD水平升高[9]。本研究結(jié)果表明，喂食谷氨酰胺的大鼠血清中CK和LDH的活性和LD含量較低，而且其力竭時間也較長，提示給大鼠補(bǔ)充谷氨酰胺可以在一定程度上降低組織細(xì)胞的損傷，減少乳酸在血液中的堆積，減緩大鼠的運(yùn)動性疲勞。谷氨酰胺是一種效力較強(qiáng)的抗氧化劑，是由甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸組成的三肽復(fù)合物[10],可顯著降低機(jī)體自由基產(chǎn)生，還能提高細(xì)胞膜穩(wěn)定性[11]，因此可以改善機(jī)體氧化還原能力，而CK、LDH和LD為機(jī)體運(yùn)動時增多自由基破壞細(xì)胞膜產(chǎn)生，故給予谷氨酰胺后可抑制自由基產(chǎn)生，提高細(xì)胞膜穩(wěn)定性，降低細(xì)胞損傷，使得小鼠CK、LDH和LD水平降低。

SOD在肌體中廣泛存在，其底物為氧自由基，具有唯一性和專一性，可以催化2O-2和2H形成H2O2，并在過氧化氫酶作用下分解為H2O和O2而被消除，是細(xì)胞膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能完整性的保護(hù)酶[12]。MDA是脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物，會加劇細(xì)胞膜的受損程度，還可以影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性[13]。機(jī)體大量運(yùn)動時會對組織器官產(chǎn)生震蕩效應(yīng)，使細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物不斷積累導(dǎo)致其滲透壓升高，由于細(xì)胞膜通透性的可逆性變化，胞內(nèi)代謝酶逸出，導(dǎo)致血清酶活性升高[14]。本研究結(jié)果表明，谷氨酰胺組大鼠力竭后，其血清和骨骼肌中GSH和SOD水平升高，同時MDA降低，提示谷氨酰胺可改善大鼠氧化還原能力。分析原因，GSH是體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，它既可以作為催化過氧化物還原的供氫體，也可以是親電子物質(zhì)結(jié)合的解毒劑，清除過量MDA、H2O2等，其有效成分谷氨酸可促進(jìn)GSH水平升高，還原被自由基氧化的SOD[15]，此外，MDA作為脂質(zhì)分解的終產(chǎn)物，谷氨酰胺保護(hù)了細(xì)胞膜，抑制細(xì)胞膜被脂質(zhì)分解，故降低MDA水平[15]。

肝細(xì)胞凋亡是引起肝臟疾病和肝臟損傷的重要原因之一。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡，是一個主動過程，由基因控制[16]。有研究表明，谷氨酰胺可以通過抑制相關(guān)基因的表達(dá)來抑制肝細(xì)胞的凋亡[1]。減少肝細(xì)胞凋亡可以保護(hù)肝臟的完整性，對于維持機(jī)體的健康狀態(tài)具有非常重要的意義。Bc1-2是凋亡抑制基因，Bax是凋亡誘導(dǎo)基因，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物Bc1-2的高表達(dá)和Bax的低表達(dá)，可以抑制肝細(xì)胞凋亡[17]。本研究結(jié)果顯示，喂食谷氨酰胺的大鼠血清中Bc1-2 基因表達(dá)水平較高，Bax 基因表達(dá)水平較低，表明谷氨酰胺具有抑制肝細(xì)胞凋亡的作用。這可能是由于谷氨酰胺上調(diào)Bc1-2在肝細(xì)胞中的表達(dá)，下調(diào)Bax在肝細(xì)胞中的表達(dá)。谷氨酰胺抑制肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚，既往研究認(rèn)為，谷氨酰胺可通過抑制線粒體凋亡途徑抑制肝細(xì)胞凋亡[18]。還有研究認(rèn)為，谷氨酰胺可提高肝細(xì)胞抗氧化能力，降低乳酸脫氫酶水平，減少微核肝細(xì)胞數(shù)目(被認(rèn)為是DNA氧化損傷的關(guān)鍵分子)，起到保護(hù)肝細(xì)胞，抑制肝細(xì)胞凋亡[19]。既往研究認(rèn)為凋亡相關(guān)因子表達(dá)較肝細(xì)胞死亡更早出現(xiàn)[17]，且大鼠年齡不同肝臟凋亡情況不一，故本研究觀察了谷氨酰胺對Bc1-2、Bax表達(dá)影響，后續(xù)可深入探討谷氨酰胺對肝細(xì)胞凋亡的影響及具體機(jī)制。

目前改善運(yùn)動性疲勞的治療方法有限，既往研究多集中于觀察谷氨酰胺對疲勞的改善作用，而對于運(yùn)動性疲勞，谷氨酰胺的作用機(jī)制及對細(xì)胞周期影響報道少見，本研究證實(shí)谷氨酰胺可通過改善機(jī)體氧化還原能力，保護(hù)骨骼肌及肝臟細(xì)胞，具有重要意義，對臨床藥物研發(fā)及深入了解谷氨酰胺對細(xì)胞功能影響具有一定指導(dǎo)意義。

綜上所述，谷氨酰胺可以調(diào)整大鼠生理狀態(tài)，緩解其運(yùn)動性疲勞，其機(jī)制可能與增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，降低其骨骼肌氧化程度，減緩其肝臟細(xì)胞凋亡有關(guān)。