劉久鵬 ， 邵淑麗,2△， 何孟奇， 黃 鑫,2， 張偉偉,2， 張珍珠,2， 陳亞楠

(1. 齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院， 2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

胃癌(gastric carcinoma, GC)是消化系統(tǒng)中最常見的一種癌癥，此種癌癥的發(fā)病率一直居高不下[1]。目前胃癌的治療手段主要依靠化療，化療雖然可以在一定程度上提高生存率，但對患者生存的改善也很有限[2]。因此，尋找一種提高治療胃癌療效的藥物是當務之急。近年來中藥提取物中的抗腫瘤成分已經(jīng)成為了治療腫瘤的新途徑，如華蟾素[3]、川楝素[4]、紫杉醇[5]等。

樺木酸屬于一種植物源性五環(huán)三萜類化合物，具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗炎和免疫調節(jié)等[6]。多項研究表明，樺木酸能夠作用于多種腫瘤細胞，包括影響肝癌腫瘤干細胞HepG2的細胞周期從而抑制其增殖[7]；通過抑制STAT3的活性抑制胰腺癌細胞的增殖并促進其凋亡[8]；通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導肝癌細胞自噬介導的細胞凋亡，抑制增殖[9]。因此樺木酸具有作為潛在抗癌藥物的開發(fā)價值。但樺木酸對人胃癌細胞的影響相關研究機制尚未見報道，因此，本實驗以人胃癌MGC-803細胞為研究對象，利用不同濃度的樺木酸對人胃癌 MGC-803細胞進行處理，探究樺木酸抑制其增殖和其對細胞周期的影響，為樺木酸治療胃癌的進一步應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌MGC-803細胞購自中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所；樺木酸購自北京漢博生物有限公司；胎牛血清購自以色列BI公司；PRMI Medium 1640 培養(yǎng)基干粉購自美國Sigma公司；總RNA 提取試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司；吉姆薩染液購自安徽雷根生物技術有限公司；BeyoClickTMEdU-488細胞增殖檢測試劑盒、Western及IP細胞裂解液、PI染液均購自上海碧云天生物技術有限公司；CCNB1、CCND1、β-actin一抗購自北京博奧森生物技術有限公司；二抗購自美國LI-COR有限公司；Power2×SYBR real-time PCR premixture 試劑盒購自北京百泰克公司；倒置熒光顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；qRT-PCR儀購自德國eppendorf公司；Odyssey雙色紅外激光掃描成像系統(tǒng)購自美國LI-COR公司；流式細胞儀購自美國Beckman公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理

人胃癌MGC-803細胞使用含有10%胎牛血清及100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2以及飽和濕度；20 mg樺木酸標準品溶于4 ml DMSO后配置成濃度為5 mg/ml 的母液。

1.3 臺盼藍拒染法測定細胞存活率

細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，不同濃度的樺木酸分別處理人胃癌細胞 MGC-803細胞24 h、48 h和72 h，光學顯微鏡下計算活細胞數(shù)量,并按公式計算細胞增殖抑制率，使用IBM SPSS軟件計算出半數(shù)抑制濃度值，即為IC50值。

細胞的增殖抑制率=1-(實驗組的平均活細胞數(shù)/對照組的平均活細胞數(shù))×100%

1.4 吉姆薩染色法檢測細胞克隆形成率

培養(yǎng)人胃癌 MGC-803細胞至對數(shù)生長期后制成細胞懸液，計數(shù)。取2 ml細胞懸液(含有100～300個細胞)接種于六孔板中，培養(yǎng)過夜，加入不同濃度的0 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml樺木酸處理細胞48 h。顯微鏡下觀察細胞克隆團形成情況；PBS清洗，用4%多聚甲醛溶液固定15 min，加入吉姆薩染色液染10 min，洗去染液。在顯微鏡下計數(shù)大于10個細胞的克隆數(shù)，計算克隆形成率。

計算公式：克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%

1.5 EdU法檢測樺木酸對人胃癌MGC-803細胞增殖的影響

用50 μmol/L EdU孵育細胞2 h；PBS洗滌1～2次后加細胞固定液，孵育0.5 h后加入甘氨酸孵育5 min，洗滌后加入滲透液孵育10 min；洗滌后加PI染色。避光孵育10 min，顯微鏡下檢測熒光情況。

1.6 流式細胞術檢測人胃癌MGC-803細胞周期

培養(yǎng)人胃癌MGC-803細胞，加不同濃度樺木酸作用48 h后，收集細胞后 PBS 洗滌 2-3 次，用9倍體積的70%乙醇4℃固定過夜， PBS洗滌后加入 500 μl PI 染液與12.5 μl RNase A 重懸細胞，37℃避光孵育30 min，使用Cytomics FC 500流式細胞儀檢測細胞周期情況。

1.7 qRT-PCR檢測CCND1和CCNB1在mRNA水平的表達

提取各處理組細胞樣品總RNA，以反轉錄的cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參，進行qRT-PCR 檢測，每組重復3次。所用引物序列見表1，得到的數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt計算各組細胞中CCNB1、CCND1 的mRNA 相對表達量。

Tab. 1 Primers for qRT-PCR

1.8 Western blot 檢測CCND1和CCNB1在蛋白水平的表達

用蛋白裂解液提取各處理組細胞總蛋白，12% SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉移至 PVDF膜上，5% 脫脂乳37℃封閉1.5 h，CCND1、CCNB1、β-actin 一抗(按 1∶300 稀釋)4℃孵育過夜，PBST洗膜3次(每次10 min)，使用Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit-IgG二抗37℃孵育1 h，洗膜3次后(每次10 min)使用Odyssey 紅外熒光掃描儀檢測，使用ImageJ軟件測蛋白條帶灰度值，再進行計算。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 人胃癌MGC-803細胞生長抑制曲線的繪制

用不同濃度的樺木酸(0 μg/ml，20 μg/ml，40 μg/ml，60 μg/ml，80 μg/ ml，100 μg/ml)處理人胃癌 MGC-803細胞24 h、48 h、72 h，采用臺盼藍拒染法檢測樺木酸對人胃癌MGC-803細胞的生長抑制作用，并繪制增殖抑制曲線。如圖1所示樺木酸可顯著抑制人胃癌 MGC-803細胞的生長，隨著作用時間的延長(24 h、48 h、72 h)抑制作用增強，且呈劑量依賴性。24 h、48 h和72 h的IC50值分別為 46.828 μg/ml，22.351 μg/ml，12.860 μg/ml，因此后續(xù)實驗選擇48 h為加藥處理時間。

Fig. 1 Effects of betulinic acid at different concentrations on the inhibition of MGC-803 cells (n=3)

2.2 樺木酸對人胃癌 MGC-803細胞克隆形成率的影響

為探究樺木酸對人胃癌 MGC-803細胞克隆形成率的影響，用不同濃度的樺木酸處理細胞48 h之后，通過吉姆薩染色法檢測細胞克隆形成率。與濃度為0 μg/ml對照組相比樺木酸處理組的克隆形成率分別降低了29.8%、34%、56.7%，說明隨樺木酸濃度增加細胞克隆形成率顯著下降(P<0.05，表2)。

2.3 樺木酸對人胃癌MGC-803細胞增殖的影響

為研究樺木酸對人胃癌MGC-803細胞增殖的影響如圖2，用0 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml的樺木酸分別處理細胞48 h后，EdU檢測細胞的增殖情況。增殖細胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，如圖2、表2所示，與0 μg/ml組相比，其余三組細胞增殖率隨樺木酸溶液濃度增加而顯著降低，分別降低了13.5%、17.85%、30.5%(P均<0.05)，實驗結果表明樺木酸能夠顯著抑制人胃癌MGC-803細胞的增殖。

Fig. 2 The effects of betulinic acid on cell proliferation rate of MGC-803 cells treated for 48 h (Bar=50 μm)

Tab. 2 Effects of betulinic acid on the clone formation rate of human gastric cancer MGC-803 cells and the relative EdU positive n=3)

2.4 樺木酸對人胃癌MGC-803 細胞周期的影響

為研究樺木酸對人胃癌MGC-803細胞周期的影響如表3，由表可知，與對照組相比，樺木酸濃度增加，G1/G0期細胞所占比例逐漸升高，分別升高了9.2%、15.7%、36.1%，由此證明樺木酸可將MGC-803細胞細胞周期阻滯在G0/G1期。

Tab. 3 Changes of cell cycle after treated with n=3)

2.5 樺木酸對人胃癌MGC-803細胞CCNB1和CCND1基因mRNA表達的影響

利用不用濃度的樺木酸處理MGC-803細胞，48 h后qRT-PCR檢測細胞周期相關蛋白CCNB1和CCND1在mRNA水平的表達。隨著樺木酸濃度的增加，CCNB1和CCND1的mRNA表達水平均顯著下降(表4)

Tab. 4 The effects of BA on mRNA levels of cyclin D1 and cyclin n=3)

2.6 樺木酸對人胃癌 MGC-803細胞CCNB1和CCND1蛋白表達的影響

利用不用濃度的樺木酸處理MGC-803細胞，48 h后對細胞周期相關蛋白CCNB1和CCND1的蛋白表達如圖3所示。隨著樺木酸濃度的增加，細胞周期相關蛋白CCNB1和CCND1的蛋白表達水平隨著藥物濃度的增加而顯著下降(P<0.01，表5)。

Fig. 3 Effect of betulinic acidon protein levels of CCNB1 and CCND1 for 48 h

Tab. 5 The effects of BA on protein levels of cyclin D1 and cyclin B1 n=3)

3 討論

胃癌作為消化系統(tǒng)中致死率較高的惡性腫瘤之一。目前手術是唯一的根治性治療方法。隨著外科手術技術的進步以及傳統(tǒng)放療、化療的進步，早期胃癌患者的存活率能達到95%以上[10]，但由于早期胃癌的診斷率低使得患者發(fā)現(xiàn)時已成為晚期胃癌。目前晚期胃癌的主要治療方法是放化療[11]。但由于放化療對患者的身體傷害較大，現(xiàn)在中醫(yī)藥治療已成為腫瘤治療的新趨勢。中藥提取物現(xiàn)已被應用到多種腫瘤的治療當中，如人參皂苷Rg5可抑制胃癌細胞增殖、遷移及侵襲[12]、白花蛇舌草能夠降低人胃癌 MNK-45細胞線粒體膜電位誘導細胞凋亡[13]。

已有研究表明樺木酸作為新發(fā)現(xiàn)的植物源性化合物在抗腫瘤和抗炎方面有效果，為驗證樺木酸是否對胃癌細胞存在影響，本實驗使用人胃癌MGC-803細胞作為研究對象。使用不同濃度樺木酸處理細胞24 h、48 h、72 h，結果顯示IC50值分別為 46.828 μg/ml，22.351 μg/ml，12.860 μg/ml。由此可見樺木酸可隨時間和劑量增長抑制胃癌細胞的生長。

細胞增殖作為細胞生命活動的重要特征之一，檢測細胞克隆形成率和EdU檢測細胞增殖率是反應細胞群體依賴性和增殖情況的重要手段[14]。本實驗使用濃度為10、20、30 μg/ml的樺木酸溶液處理細胞48 h，使用臺盼藍拒染法、吉姆薩染色和EdU等實驗手段檢測細胞的克隆形成率和細胞增殖率均明顯降低，且呈劑量和時間依賴性(表2中30 μg/ml組的克隆形成率最低但誤差值較大所以20 μg/ml組的統(tǒng)計學差異更大)；結果均說明樺木酸可抑制人胃癌MGC-803細胞增殖。

CCND1作為調控細胞周期G1期的關鍵蛋白[15]，在G1期到S期中起重要作用[16]。CCNB1蛋白質也是細胞周期G2/M檢測點關鍵的調控因子，在細胞G2期到M期過程中發(fā)揮關鍵作用[17]。本研究通過流式細胞術、qRT-PCR和Western blot 進行細胞周期、mRNA和蛋白水平的檢測。結果顯示MGC-803細胞的細胞周期阻滯在S期，樺木酸使得CCND1和CCNB1在mRNA和蛋白水平均表達下調。

綜上所述，樺木酸通過下調CCND1和CCNB1的表達將細胞阻滯在G0/G1期從而抑制人胃癌細胞MGC-803增殖。