易賽妮，張文嬌，李良遠(yuǎn)，肖承鴻，唐鑫，劉芹，蘇大鵬，胥春云，張進(jìn)強(qiáng)，周濤

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025)

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞，在突觸連接和去除凋亡細(xì)胞中起到重要作用[1]。在正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞通常處于靜息狀態(tài)，可通過吞噬作用清除細(xì)胞碎片從而維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[2]。但當(dāng)大腦發(fā)生創(chuàng)傷、炎癥或感染時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可分為經(jīng)典(M1)表型和選擇性激活(M2)表型[3]。其中M1表型的小膠質(zhì)細(xì)胞可由內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)得到，其通常表現(xiàn)為胞體膨大，分枝縮短，呈阿米巴樣形態(tài)[4]，可通過分泌神經(jīng)毒性物質(zhì)(如ROS)和炎癥細(xì)胞因子(如IL-1β、TNF-α等)產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用[5-6]。已有研究證明，經(jīng)典激活的小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥疾病中扮演著重要角色[7]，故抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的M1型激活可成為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的重要途徑。

馬錢子苷(loganin)屬環(huán)烯醚萜苷類化合物，為中國(guó)傳統(tǒng)中藥山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)的重要指標(biāo)性成分，現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗炎、抗免疫及神經(jīng)保護(hù)作用[8]?；诖?，本研究以LPS刺激原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，探討馬錢子苷對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響及其分子機(jī)制，為馬錢子苷應(yīng)用于神經(jīng)炎癥的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad);Centrifuge 5810 R冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus BX51)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

馬錢子苷(成都埃爾法生物科技有限公司)；LPS(美國(guó) Sigma)；4%多聚甲醛固定液、引物(四川生工生物有限公司)；小鼠抗Iba1抗體、兔抗iNOS抗體、兔抗CD68抗體、兔抗NF-κB抗體(英國(guó) Abcam)；Alexa Fluor 594 Conjugate山羊抗小鼠、Alexa Fluor 488 Conjugate山羊抗兔(美國(guó)Cell Signaling Technology)；無(wú)菌PBS緩沖液、DAPI染色液(武漢博士德生物工程有限公司)；Myco-3(德國(guó)Applichem)；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清(美國(guó) Gibco)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料

C57BL/6J小鼠3只，出生2 d，雌雄不限，購(gòu)自湖南省長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(湘)2019-0014。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

C57BL/6J小鼠3只，出生2 d，脫臼處死，75%乙醇消毒3～5 s，取出全腦放入無(wú)菌PBS緩沖液中洗凈表面血跡，移除小腦，剝離腦膜。吹吸粉碎大腦組織后600 r/min離心3 min，保留沉淀。0.125%胰蛋白酶37 ℃消化3～5 min，加入內(nèi)含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。使用70 μmol/L細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液，離心，取底部沉淀即為細(xì)胞，加入小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基(45 mL DMEM、5 mL PBS、100 μL青鏈霉素混合液、500 μL Myco-3)10～15 mL，移液槍吹打分散。將細(xì)胞懸液打入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱孵育，24 h后更換培養(yǎng)基，之后每3 d更換一次培養(yǎng)基，至細(xì)胞培養(yǎng)10 d左右后，用震蕩分離法分離純化即得原代小膠質(zhì)細(xì)胞，將小膠質(zhì)細(xì)胞以5×105的比例接種于24孔板中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 藥物處理

將分離純化得到的小膠質(zhì)細(xì)胞接種于24孔板中，放入37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分為4個(gè)組，分別為空白對(duì)照組、模型組和不同濃度的馬錢子苷處理組(50、100、200 μmol/L)，每組3個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組不做特殊處理，模型組每孔加入10 μL LPS(10 μg/mL)，給藥組分別加入不同濃度馬錢子苷，放入培養(yǎng)箱15～30 min后取出，除空白對(duì)照組外每孔加入LPS 10 μL，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

2.3 免疫細(xì)胞染色及熒光成像

2.4 定量PCR檢測(cè)炎癥因子表達(dá)

藥物處理24 h后，吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌1遍，每孔加入1 mL Trizol裂解液，室溫放置5 min提取細(xì)胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行純化及反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。采用定量PCR技術(shù)，在擴(kuò)增曲線的線性階段測(cè)定每個(gè)反應(yīng)的閾值擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct)。每管反應(yīng)混合物包括1 μL模板cDNA、5 μL MasterMix和1 μL引物，加入DEPC水，總體系為10 μL，瞬離后放入CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，在98 ℃預(yù)變性2 s，70 ℃退火5 s，并延伸，該過程重復(fù)35個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，相關(guān)基因的表達(dá)按照2-ΔΔct的方法計(jì)算。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.5 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)

藥物處理24 h后離心收集細(xì)胞上清液。按照BCA蛋白測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行操作，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線后，計(jì)算樣品的總蛋白濃度，將樣品稀釋到相同濃度后嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作測(cè)定TNF-α、IL-1β蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及顯著性分析

3 結(jié)果與分析

3.1 小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化

混合小膠質(zhì)細(xì)胞體外分離培養(yǎng)1～3 d時(shí)，可見懸浮于培養(yǎng)基中的圓形小膠質(zhì)細(xì)胞及貼壁生長(zhǎng)的片狀、條狀星形膠質(zhì)細(xì)胞(如圖1A～1C所示)；4～5 d時(shí)，懸浮的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多，底部星形膠質(zhì)細(xì)胞呈片狀鋪滿(如圖1D、1E所示)；6～8 d小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量逐漸增多至峰值，底部星形膠質(zhì)細(xì)胞呈片狀鋪滿(如圖1F～1H所示)。混合培養(yǎng)一周左右，當(dāng)上層懸浮的小膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)(大多數(shù)小膠質(zhì)細(xì)胞還未長(zhǎng)出分枝之前)，從混合膠質(zhì)細(xì)胞中將小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化。剛分離純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞在顯微鏡下觀察呈圓形(如圖1I所示)，于體外培養(yǎng)1～2 d可見其形態(tài)不規(guī)則，呈短棒狀，有突起伸出(如圖1J、1K所示)。用細(xì)胞純度檢測(cè)方法：(IBA1標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量/DAPI細(xì)胞數(shù)量)×100%，結(jié)果顯示細(xì)胞純度達(dá)到99.3%以上，可用于后續(xù)研究。

注：圖A～H分別為分離培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8 d的混合膠質(zhì)細(xì)胞；圖I為從混合膠質(zhì)細(xì)胞中剛純化得到的小膠質(zhì)細(xì)胞；圖J為純化得到的小膠質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)1 d的形態(tài)圖；圖K為純化得到的小膠質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)2 d的形態(tài)圖；圖L為小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色圖，IBA1標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞(紅色)，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核(藍(lán)色)。圖1 原代小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化培養(yǎng)Fig.1 Isolation,purification,and culture of primary microglia

3.2 馬錢子苷干預(yù)對(duì)LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響

免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS處理組小膠質(zhì)細(xì)胞可觀察到呈現(xiàn)阿米巴樣巨噬細(xì)胞形態(tài)，表明LPS能夠成功誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向M1表型激活。且LPS處理后小膠質(zhì)細(xì)胞胞體膨大，細(xì)胞核面積顯著增加(P<0.005)。用3個(gè)不同濃度的馬錢子苷干預(yù)后，均能顯著減少小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞總面積和細(xì)胞核面積(P<0.001)(圖2)。

注：IBA1(紅色)標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，DAPI(藍(lán)色)標(biāo)記細(xì)胞核，Merge表示三色疊加。圖2 馬錢子苷干預(yù)對(duì)LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.2 Effects of loganin on LPS-activated microglia morphology

3.3 馬錢子苷干預(yù)對(duì)LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

定量PCR結(jié)果顯示，與空白組相比，LPS組小膠質(zhì)細(xì)胞所分泌的促炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)，表明此時(shí)的小膠質(zhì)細(xì)胞由靜息狀態(tài)向M1型活化。與LPS組相比，50 μmol/L的馬錢子苷預(yù)處理組TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，IL-1β表達(dá)水平雖有下降但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而100 μmol/L與200 μmol/L的馬錢子苷干預(yù)組TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)(如圖3所示)。

圖3 馬錢子苷干預(yù)對(duì)LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of loganin on the expression of inflammatory cytokine mRNAs in LPS-activated microglia

3.4 馬錢子苷干預(yù)對(duì)LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)的影響

誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)可催化生成一氧化氮(NO)從而參與炎癥和腫瘤形成，本研究通過檢測(cè)iNOS的蛋白表達(dá)量從而反映細(xì)胞發(fā)生炎性活化的程度。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS組小膠質(zhì)細(xì)胞綠色熒光增強(qiáng)，陽(yáng)性染色面積更大，表示細(xì)胞被激活且細(xì)胞內(nèi)有iNOS蛋白表達(dá)(圖4B1～B4)。與LPS模型組相比，50、100、200 μmol/L的馬錢子苷干預(yù)組均可見綠色熒光強(qiáng)度及染色面積都有一定程度的降低，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)iNOS蛋白表達(dá)下降，表示細(xì)胞被激活但是激活程度有所降低(如圖4 C1～ E4所示)。

注：iNOS(綠色)標(biāo)記胞內(nèi)iNOS蛋白，IBA1(紅色)標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，DAPI(藍(lán)色)標(biāo)記細(xì)胞核，Merge表示三色疊加。圖4 馬錢子苷干預(yù)對(duì)LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of loganin on iNOS protein expression in LPS-activated microglia

3.5 馬錢子苷干預(yù)對(duì)LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子蛋白質(zhì)含量的影響

ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、TNF-α的蛋白質(zhì)含量顯著增加(P<0.001)；與LPS處理組相比，100 mmol/L馬錢子苷干預(yù)組細(xì)胞IL-1β、TNF-α的含量顯著減少(P<0.05)(圖5)。

圖5 馬錢子苷干預(yù)對(duì)LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子蛋白質(zhì)含量的影響Fig.5 Effects of loganin on the protein contents of inflammatory factors in LPS-activated microglia

3.6 馬錢子苷干預(yù)對(duì)LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路的影響

NF-κB為一種重要的多向性細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB被激活后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮其重要作用，并參與炎癥反應(yīng)。本研究通過檢測(cè)NF-κB在小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)情況，反映小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性活化程度。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS組小膠質(zhì)細(xì)胞綠色熒光更強(qiáng)(圖6 B1)，且胞體明顯膨大(圖6 B2)，表示NF-κB信號(hào)通路被激活。與LPS模型組相比，50 μmol/L、100 μmol/L馬錢子苷干預(yù)組細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度均有所降低(圖6 C1、D1)；在200 μmol/L馬錢子苷干預(yù)下細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度甚至消失(圖6 E1)，細(xì)胞核及總細(xì)胞面積均有所減少(圖6E2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低、中、高濃度的馬錢子苷干預(yù)能抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路激活，從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型極化。

注：NF-κB(綠色)標(biāo)記胞內(nèi)NF-kB蛋白，IBA1(紅色)標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，DAPI(藍(lán)色)標(biāo)記細(xì)胞核，Merge表示三色疊加。圖6 馬錢子苷干預(yù)對(duì)LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的NF-kB信號(hào)通路的影響Fig.6 Effects of loganin on NF-κB signaling pathway of LPS-activated microglia

4 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞在大腦的發(fā)育、腦環(huán)境的維持和腦疾病監(jiān)視中起著重要作用[9-10]，其能夠通過吞噬細(xì)胞碎片和蛋白聚集體維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[11]。正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于相對(duì)靜息狀態(tài)，但在遭受腦損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞可以被激活為M1表型和M2表型[12]。其中M1表型小膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子(如TNF-α，IL-1β，IL-12)，并表達(dá)高水平的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)以促進(jìn)NO的產(chǎn)生，這些炎癥介質(zhì)的進(jìn)一步積累可引起神經(jīng)毒性，并損傷神經(jīng)元[13]。小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)與腦內(nèi)受損傷部位的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，因此，尋找一種能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞M1型活化的藥物成為腦疾病治療的研究熱點(diǎn)。

LPS是一種已知的神經(jīng)毒素[14]，可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞成M1表型并表達(dá)促炎細(xì)胞因子，誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥的發(fā)生，目前被作為神經(jīng)退行性變的膠質(zhì)細(xì)胞激活劑廣泛應(yīng)用[15]。本研究利用LPS處理原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞，并分別給予低、中、高濃度的馬錢子苷干預(yù)。結(jié)果顯示，LPS刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體膨大、分支縮短，呈現(xiàn)出明顯活化的阿米巴樣形態(tài)。而用馬錢子苷干預(yù)后，小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞總面積及細(xì)胞核面積均顯著減少，幾乎恢復(fù)到與空白對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃?，并觀察到細(xì)胞呈現(xiàn)與空白對(duì)照組相似的分支形態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞肥大是其活化后蛋白表達(dá)增加的表現(xiàn)[16]。本研究也發(fā)現(xiàn)，LPS處理后，小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子量顯著增加，而3個(gè)不同濃度的馬錢子苷均可顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)增加；中濃度的馬錢子苷能使LPS刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α的蛋白質(zhì)含量顯著降低；3個(gè)不同濃度的馬錢子苷均能下調(diào)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)。

核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)是一種能控制DNA的轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞因子合成的蛋白復(fù)合物，廣泛存在于神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞中，能夠調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)并參與免疫反應(yīng)[17]。iNOS是NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，iNOS基因的部分啟動(dòng)子序列能與NF-κB特異性結(jié)合，從而使NF-κB被激活并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，編碼相應(yīng)產(chǎn)物(如iNOS、TNF-α、IL-6等)[18]。因此，阻斷此通路對(duì)于活化小膠質(zhì)細(xì)胞引起的神經(jīng)炎性疾病的治療具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索了馬錢子苷干預(yù)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路的影響，我們的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)LPS處理后iNOS蛋白表達(dá)量增加，這讓NF-κB的核轉(zhuǎn)移程度顯著升高，NF-κB信號(hào)通路被激活，細(xì)胞表現(xiàn)為M1型。但低、中、高劑量的馬錢子苷能抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)移，從而抑制細(xì)胞向M1表型轉(zhuǎn)化。上述結(jié)果提示，馬錢子苷可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的M1型活化，降低炎癥因子表達(dá)，其相關(guān)分子機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路激活有關(guān)。