陳 鳳,楊 敏,李彥潔,彭 凌,黃華鑫,彭 運(yùn)

(深圳市第三人民醫(yī)院 感染病國(guó)家重點(diǎn)?？?深圳 518112)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一類來(lái)源于中胚層的成體干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化的潛能。研究表明，MSCs廣泛存在于成體及胎兒的各種組織中，如骨髓[1]、外周血[2]、脂肪組織[3]、羊膜和臍帶[4]、胎盤[5]、牙髓[6]、皮膚等[7]。迄今為止，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)仍是研究和應(yīng)用最廣泛的，但獲取骨髓對(duì)人體傷害大，來(lái)源有限，限制了它在臨床上的應(yīng)用。目前的研究已證明，人臍帶的華通氏膠內(nèi)含有豐富的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)，作為一種較原始的MSCs，具有容易獲得、較低的免疫原性和多向分化的特點(diǎn)，成功避開(kāi)了胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)和BMSCs在使用過(guò)程中的諸多限制，從而被廣泛用于多種疾病的治療，取得較好的療效，是干細(xì)胞研究的重要來(lái)源[8-10]。目前，已有較多研究通過(guò)組織貼壁的方法成功分離培養(yǎng)hUCMSCs，但不同研究條件下可能導(dǎo)致所獲得的細(xì)胞來(lái)自不同的亞群，其生物學(xué)特性可能存在差異，從而制約了人們對(duì)hUCMSCs的認(rèn)識(shí)。因此，通過(guò)生物學(xué)方法不斷豐富對(duì)hUCMSCs特性的認(rèn)識(shí)，將有利于促進(jìn)干細(xì)胞臨床應(yīng)用的發(fā)展。鑒于此，對(duì)臍帶組織中的MSCs做分離培養(yǎng)，并對(duì)其生物學(xué)特性和多向分化潛能進(jìn)行鑒定，以期為干細(xì)胞的臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

臍帶組織取自深圳市第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科健康產(chǎn)婦足月剖宮產(chǎn)的胎兒。研究?jī)?nèi)容已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)和參加者的知情同意。

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、成脂成骨成軟骨分化培養(yǎng)基(Gibco公司)；流式細(xì)胞儀、CD34-PE、CD44-PE、CD45-PE、CD105-PE單克隆抗體(BD公司)；Easypure?RNA kit、TransScript?All-in-one first-stand CDNA Synthesis superMix for qPCR(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

無(wú)菌采集健康產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)中的胎兒臍帶15～20 cm，裝入預(yù)先放置PBS(含2%青霉素+2%鏈霉素)的密封玻璃瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室。于實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺(tái)內(nèi)，反復(fù)沖洗以除去臍帶組織表面的血凝塊，用止血鉗夾住臍帶兩端，放入75%醫(yī)用酒精浸泡1 min左右；然后轉(zhuǎn)移至PBS中清除臍帶表面殘余的酒精，將臍帶剪成2～3 cm的片段，放入PBS中，以除去臍帶動(dòng)脈、靜脈中的血細(xì)胞；隨后用組織剪剪開(kāi)臍靜脈，去除臍靜脈、臍動(dòng)脈及臍帶外膜，分離出華通氏膠組織(Wharton gel)，PBS反復(fù)沖洗后將Wharton gel剪成2～3 mm組織塊均勻鋪于60 mm培養(yǎng)皿中，加入少量DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青霉素+1%鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞表面抗原檢測(cè)

取傳代培養(yǎng)至P3的hUCMSCs，胰酶消化收集細(xì)胞，加入PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，取200 μL細(xì)胞懸液按照抗體使用說(shuō)明書(shū)分別加入相應(yīng)量帶有熒光標(biāo)記的單抗(CD34-PE、CD44-PE、CD45-PE、CD105-PE)混勻，室溫避光孵育30 min，隨后1 200 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗2遍后，加入300 μL PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀，檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)。

1.2.3 多能性相關(guān)基因的表達(dá)

取傳代培養(yǎng)至P4的hUCMSCs，分別按照Easypure?RNA kit和TransScript?All-in-one first-stand CDNA Synthesis superMix for qPCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，Tm退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察hUCMSCs中與多能性相關(guān)基因Oct4、Sox2和Nanog的表達(dá)情況。各基因的PCR引物如表1所示。

表1 多能性相關(guān)基因的引物序列Table1 Primers for pluripotent related genes

1.2.4 多向分化潛能的鑒定

取傳代培養(yǎng)至P4的hUCMSCs，以1×105個(gè)/孔接種到6孔板中，成脂、成骨、成軟骨及各自的對(duì)照各2孔，待細(xì)胞貼壁后，分化組分別加入分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對(duì)照組加入普通培養(yǎng)液(DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素+1%鏈霉素)。將所有組細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次。成脂、成骨、成軟骨組分別在D10、D18和D21停止誘導(dǎo)。采用組織染色和RT-PCR方法對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。成脂分化組行油紅O染色并鑒定LPL和PPAR基因的表達(dá)；成骨分化組行茜素紅染色并鑒定ALP和OCN基因的表達(dá)；成軟骨分化組行阿爾新藍(lán)染色并鑒定CoI-II和COMP基因的表達(dá)。各基因的PCR引物如表2所示。

表2 成脂、成骨、成軟骨標(biāo)志基因的引物序列Table 2 Primers for expression of adipogenic,osteogenic and chondrogenic marker genes

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

臍帶組織貼壁培養(yǎng)5 d，可見(jiàn)組織塊的周圍長(zhǎng)出少量的貼壁細(xì)胞，形態(tài)呈細(xì)小的梭形，10 d左右細(xì)胞迅速增殖，14 d時(shí)局部細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%，形態(tài)為長(zhǎng)梭形，排列緊密，呈平行或漩渦狀生長(zhǎng)。

2.2 細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)

從臍帶組織分離出的細(xì)胞高度表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44和CD105，但低表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34和CD45(圖1)，說(shuō)明從臍帶分離出的纖維樣形態(tài)的貼壁細(xì)胞具有MSCs的生物學(xué)特性。

圖1 底物/氧/銅離子的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程Figure 1 Substrates/oxygen/copper ions electronic transfer pathway of laccase

2.3 多能性相關(guān)基因的表達(dá)

通過(guò)進(jìn)一步證實(shí)從臍帶組織分離出的細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞的表面標(biāo)志基因Oct4和Nanog，但是不表達(dá)Sox2基因，這些結(jié)果表明獲得的細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。

2.4 多向分化潛能

成脂分化誘導(dǎo)中，可見(jiàn)細(xì)胞由纖維狀逐漸變?yōu)閳A形或橢圓形，3 d時(shí)可見(jiàn)少量脂滴形成，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)空泡樣的脂滴增多變大，于第10天行油紅O染色，可見(jiàn)細(xì)胞漿中有大量紅色的油滴[圖2(a)]，對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)明顯的油滴形成[圖2(a′)]；RT-PCR表明誘導(dǎo)后的hUCMSCs表達(dá)PPAR，低量表達(dá)LPL基因(圖3)。成骨分化誘導(dǎo)中，細(xì)胞逐漸變?yōu)槎趟笮?，于?8天行茜素紅染色，可見(jiàn)胞漿內(nèi)有大量紅色的鈣結(jié)節(jié)[圖2(b)]，對(duì)照組未見(jiàn)明顯的鈣結(jié)節(jié)形成[圖2(b′)]；RT-PCR表明誘導(dǎo)后的hUCMSCs表達(dá)ALP和OCN特異基因(圖3)。成軟骨分化誘導(dǎo)中，細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)槎嘟切?、多邊形，其中夾雜著紡錘狀細(xì)胞，于第21天行阿爾新藍(lán)染色可染成淡藍(lán)色[圖2(c)]，對(duì)照組未變色[圖2(c′)]，提示分化后細(xì)胞產(chǎn)生軟骨基質(zhì)；RT-PCR表明誘導(dǎo)后的hUCMSCs表達(dá)CoI-II和COMP特異基因(圖3)。

(a)成脂分化組;(a′):成脂分化對(duì)照組。(b)成骨分化組;(b′)成骨分化對(duì)照組。(c):成軟骨分化組;(c′)成軟骨分化對(duì)照組。圖2 組織染色鑒定多向分化潛能Figure 2 Immunostaining identified the multipotent differentiation potential

1：成脂分化組;2：成脂分化對(duì)照組;3：成骨分化組;4：成骨分化對(duì)照組;5：成軟骨分化組;6：成軟骨分化對(duì)照組。圖3 RT-PCR鑒定多向分化潛能Figure 3 RT-PCR identified the multipotent differentiation potential

3 討論與結(jié)論

hUCMSCs作為一種較原始的多能干細(xì)胞，其多向分化能力和可塑性已得到廣泛證實(shí)，在組織工程和細(xì)胞替代治療方面具有可觀前景。已有研究表明，臍帶組織中，每厘米含有4×105個(gè)干細(xì)胞，數(shù)量遠(yuǎn)高于骨髓[11]，而且臍帶組織容易獲得、生長(zhǎng)能力更強(qiáng)，多潛能特性能在體外保留更長(zhǎng)時(shí)間[12]，是干細(xì)胞研究的重要來(lái)源。

研究對(duì)臍帶組織中的MSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)，目前常用的方法有酶消化法和組織塊貼壁法，采用酶消化法所用時(shí)間雖短但獲得的細(xì)胞純度不高，且酶對(duì)細(xì)胞質(zhì)量影響大，而組織塊貼壁法雖需要較長(zhǎng)時(shí)間，但更有利于保持細(xì)胞的活性。鑒于此，采用組織塊貼壁法進(jìn)行原代培養(yǎng)，14 d可見(jiàn)組織塊的周圍長(zhǎng)出大量細(xì)胞，原代培養(yǎng)周期與其他研究相近[13]，甚至短于另外一些文獻(xiàn)的報(bào)道[14]，可能與局部的細(xì)胞生長(zhǎng)較快有關(guān)。hUCMSCs具有間質(zhì)、內(nèi)皮和上皮細(xì)胞的特點(diǎn)，不表達(dá)造血干細(xì)胞的標(biāo)志物，結(jié)果表明獲得的細(xì)胞低表達(dá)CD34和CD45，排除了它是造血細(xì)胞的可能，但高表達(dá)CD44和CD105，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的hUCMSCs標(biāo)志物一致[15-16]。值得注意的是，獲得的細(xì)胞高表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物Oct4和Nanog，但不表達(dá)Sox2，與課題組前期在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)類似[17]?？赡苁怯捎赟ox2在體外主要表達(dá)在未分化的胚胎干細(xì)胞和胚胎癌細(xì)胞中，雖然hUCMSCs具有干細(xì)胞的特性，但可能隨著傳代逐漸分化，提示在傳代培養(yǎng)hUCMSCs過(guò)程中，需要添加額外的細(xì)胞生長(zhǎng)因子以維持其活性不發(fā)生變化。

MSCs具有的多向分化潛能特性一直被認(rèn)為是其最大的應(yīng)用價(jià)值，加上它較低的免疫原性、安全性更高的特點(diǎn)，使其成為組織工程的優(yōu)良種子，因此，對(duì)MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化的研究具有重要的意義。成脂誘導(dǎo)3 d，胞質(zhì)中開(kāi)始有高折光性的小脂滴出現(xiàn)，標(biāo)志著脂質(zhì)開(kāi)始積累，分化誘導(dǎo)10 d，高表達(dá)成脂分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARY，而脂蛋白脂酶(LPL)只有微弱表達(dá)，表明hUCMSCs在分化液的誘導(dǎo)作用下可高度轉(zhuǎn)變?yōu)橹炯?xì)胞，但僅表現(xiàn)出輕微的脂肪細(xì)胞的分泌特性。成骨誘導(dǎo)18 d，組織染色可見(jiàn)明顯的鈣結(jié)節(jié)形成，同時(shí)表達(dá)了骨再生早期和后期的代表性因子ALP和OCN，提示其向成骨細(xì)胞進(jìn)行了分化。成軟骨誘導(dǎo)21 d，細(xì)胞產(chǎn)生軟骨基質(zhì)，并表達(dá)CoI-II和COMP。綜上，證實(shí)了hUCMSCs具有成脂成骨成軟骨的分化特性，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[4,18-19]。

通過(guò)組織塊貼壁的方法，在第14天獲得大量來(lái)自臍帶組織的細(xì)胞，經(jīng)鑒定其表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和CD105，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志物CD34和CD45，表達(dá)多能性相關(guān)基因Oct4和Nanog，并具有成脂、成骨、成軟骨的分化潛能，表明獲得的細(xì)胞具有干細(xì)胞的生物學(xué)特性，屬臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞。研究為體外建立高效穩(wěn)定的臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞及臨床移植治療相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。